Obrazowanie na żywo ekstruzji komórek z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego

Utrzymanie tkanek nabłonkowych wymaga ciągłego usuwania uszkodzonych i obumierających komórek bez naruszania funkcji bariery. Aby to osiągnąć, nabłonek usuwa obumierające komórki poprzez tworzenie i kurczenie pierścienia aktyny i miozyny w komórkach otaczających komórkę obumierającą, co pozwala na jej wyrzucenie przy jednoczesnym zamykaniu wszelkich luk, które mogły powstać w wyniku jej usunięcia. W tym artykule wideo przedstawiono metodę indukcji i obrazowania ekstruzji komórek apoptotycznych z naskórka larw ryby danio pręgowanego w czasie rzeczywistym.

W pokazany sposób osiąga się to poprzez wstrzyknięcie sondy F-aktyny znakowanej czerwonym białkiem fluorescencyjnym do zarodków transgenicznych danio pręgowanego na jednym z etapów rozwoju, które wykazują ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego w naskórku, aby zwizualizować filamenty aktynowe w tkankach nabłonkowych. Larwy w czwartym dniu po zapłodnieniu, wykazujące ekspresję zarówno GFP, jak i RFP, są następnie traktowane G418 w celu indukowania apoptozy w naskórku. Dynamika aktyny oraz zmiany kształtu komórek nabłonkowych zachodzące podczas ekstruzji są wizualizowane za pomocą obrazowania time-lapse na konfokalnym mikroskopie z dyskiem wirującym.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analizy sił immunologicznych, jest możliwość obserwacji gwałtownych zmian i dynamiki aktyny zachodzących podczas procesu ekstruzji w żywej tkance nabłonkowej. W tym filmie przedstawimy procedurę obrazowania ekstruzji komórek apoptotycznych z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego w czasie rzeczywistym. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby zrozumieć, w jaki sposób komórki koordynowanie reorganizują swój cytoszkielet aktynowy w celu usunięcia komórek apoptotycznych przy jednoczesnym zachowaniu funkcji barierowej oraz w jaki sposób zaburzenia procesu ekstruzji mogą prowadzić do określonych stanów chorobowych.

Zacznijmy zatem. Aby zwizualizować dynamikę aktyny podczas ekstruzji komórek w naskórku rozwijającego się danio pręgowanego, należy rozpocząć od rozmrożenia wcześniej przetranskrybowanego RNA na lodzie. Transkrybujemy mRNA kodujące czerwone białko fluorescencyjne połączone z domeną homologii kalpainy utrofiny oraz białkiem wiążącym aktynę. Dodaj czerwień fenolową do RNA w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać końcowe stężenie RNA wynoszące około 30 ng/µL, a następnie załaduj 1 µL roztworu do wyciągniętej igły kapilarnej poprzez napełnianie wsteczne.

Zebrać około 75 embrionów C-K-G-F-P w stadium 1 komórki do buforu E trzy. Za pomocą pipety Pastera o średnicy 5 ¾ przenieść zebrane embriony do formy do mikroiniekcji i delikatnie ułożyć je w rowku za pomocą pęsety Dumont nr 5. Pracować szybko, aby uniknąć konieczności iniekcji RNA do embrionów w różnych stadiach rozwoju, korzystając ze standardowego laboratoryjnego stereomikroskopu sekcyjnego.

Użyj mikroinjektora sterowanego ciśnieniem, aby wstrzyknąć RNA do żółtka embrionów jako kontrolę fenolową. Po iniekcji w embrionie powinien być widoczny kolor czerwony. Należy upewnić się, że w każdym eksperymencie poddano iniekcji co najmniej 50 embrionów.

Posegreguj embriony, aby usunąć wszystkie niezapłodnione lub uszkodzone jaja, a następnie inkubuj pozostałe embriony w temperaturze 28°C. Po 24 godzinach, używając fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, wybierz embriony danio pręgowanego, które wykazują wysoki poziom fluorescencji GFP w naskórku oraz fluorescencję znakowaną RFP. Inkubuj wybrane embriony w temperaturze 28°C do momentu rozpoczęcia leczenia farmakologicznego w celu indukcji apoptozy poprzez ekspozycję na aminoglikozyd.

Antybiotyk G 418 lub lek wywołuje ekstruzję komórek apoptotycznych z naskórka rozwijających się larw zebrafish. Co istotne, aby wywołać ekstruzję komórek, zabieg ten działa wyłącznie na larwy w 4. dniu po zapłodnieniu i starsze. Przenieś do szalki hodowlanej o wymiarach 35 × 10 mm zawierającej 3 mL pożywki E3 do 25 larw zebrafish w 4. dniu po zapłodnieniu, wykazujących ekspresję zarówno GFP, jak i RFP.

Ostrożnie zastąp medium trzema mililitrami E three zawierającego 1 mg/mL G four 18 i inkubuj larwy w leku przez cztery godziny w ciemności w temperaturze 28 °C. Następnie usuń medium i zastąp je podgrzanym wcześniej medium E three zawierającym 0,02% trica, a następnie przystąp do montowania larw do obrazowania. Przenieś do trzech larw do probówki typu fendor o pojemności 1,5 mL i usuń większość medium E three.

Za pomocą przyciętej końcówki pipety pipetować 120 µL 1% low melt agarose do probówki i wymieszać. Następnie delikatnie przenieść larwy wraz z mieszaniną agarose na szkiełko nakrywkowe znajdujące się na dnie naczynia hodowlanego Matech. Używając uchwytu do pinów FST z włożonym pinem lub przymocowaną igłą wolframową, szybko zorientować larwy tak, aby leżały prosto i płasko na szkiełku nakrywowym.

Pozostaw agarozy do stężenia. Następnie delikatnie wypełnij szalkę pożywką E3 zawierającą 0,02% trica. Stwierdziliśmy, że cały proces ekstruzji komórek apoptotycznych z naskórka rozwijających się larw zebrafish trwa około 20 minut.

W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przygotować eksperyment obrazowania time-lapse z wykorzystaniem konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym oraz oprogramowania and or IQ w celu zebrania serii płaszczyzn Z przez pojedynczą warstwę naskórka danio pręgowanego. Najpierw, za pomocą oprogramowania and or IQ, włącz lasery argonowe i helowo-neonowe, kamerę mikroskopową oraz lampę epifluorescencyjną. Następnie utwórz protokół serii czasowej zawierający długości fal, które mają zostać zobrazowane.

Częstotliwość odstępów między przejęciami obrazów oraz liczba powtórzeń każdego przejęcia. Ostrożnie umieść szalkę mattec zawierającą preparat na stoliku mikroskopu, a następnie użyj obiektywu 20x i światła przechodzącego, aby ustawić ostrość na larwy. Przesuń obiektyw imersyjny w wodzie 40x do właściwej pozycji. Korzystając z tego obiektywu, możemy filmować około 20 do 25 komórek w jednym polu widzenia, co pozwala nam śledzić zachowania komórkowe podczas ekstruzji, przy jednoczesnej rozdzielczości dynamiki aktyny na poziomie subkomórkowym.

Ostrożnie nanieś kroplę wody na górną część obiektywu 40x, a następnie szybko umieść na niej szalkę Mattec. Zidentyfikuj preparat, korzystając z oświetlenia w polu jasnym, a następnie użyj epi-fluorescencji o długości fali 488 nm, aby ustawić ostrość konkretnie na skórę wykazującą ekspresję GFP. Przełącz urządzenie w tryb skanowania konfokalnego.

Odpowiednio dostosuj intensywność lasera i czas ekspozycji dla każdego z kanałów. Należy zadbać o zrównoważenie mocy lasera i czasu ekspozycji w celu optymalnej detekcji sygnału oraz zapobiegania fototoksyczności. Aby zidentyfikować ekstrudujące komórki, wykorzystaj fluorescencję epi do wizualizacji epidermy znakowanej GFP i zidentyfikuj grupę komórek w klasycznym wzorze rozety, składającą się ze zbioru komórek otaczających małą, okrągłą komórkę w centrum.

Dodatkowo, wokół małej, okrągłej komórki w centrum powinno być widoczne nagromadzenie aktyny znakowanej RFP w formie pierścienia, co jest charakterystyczną cechą ekstruzji komórki. Po zidentyfikowaniu ekstrudującej komórki należy szybko ustawić górną i dolną granicę serii Z oraz wielkość kroku. Następnie należy rozpocząć akwizycję czterech konfokalnych zestawów danych 4D, aby przeanalizować dane oraz zwizualizować skurcz pierścienia aktynowego i zachowania nabłonkowe występujące wokół obumierającej komórki.

W czasie wykonaj projekcje 3D serii Z i zapisz dane w formie pliku wideo. Krok ten można zrealizować przy użyciu różnych pakietów oprogramowania. Rysunek ten przedstawia ekspresję RFP UTR CH w naskórku larwy zebrafish CK GFP w czwartym dniu po zapłodnieniu.

Poniżej przedstawiono projekcje Z pojedynczych klatek z filmu time-lapse, które obrazują dynamikę procesów zachodzących na żywo. Podczas procesu ekstruzji komórek nabłonkowych strzałki wskazują pierścień aktyny utworzony przez sąsiednie komórki, który kurczy się i zamyka w ciągu dwóch minut. Po przeprowadzeniu tej procedury możemy zastosować inne metody w połączeniu z tą techniką, takie jak wykorzystanie inhibitorów chemicznych lub mutacji genetycznych, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób zaburzenia ekstruzji mogą prowadzić do określonych stanów chorobowych.

W związku z niepowodzeniem w usuwaniu komórek apoptotycznych, zaprezentowaliśmy właśnie sposób przygotowania eksperymentu obrazowania time-lapse w celu wizualizacji procesu ekstruzji z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby ograniczyć ilość światła padającego na preparat, aby zapobiec fotoblaknięciu lub toksyczności. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.