Charakterystyka izolowanego, wentylowanego i opomiarowanego płuca mysiego poddanego perfuzji przepływem pulsacyjnym

Celem badania jest analiza zależności między pulsacyjnym przepływem a ciśnieniem w płucach. Niniejszy protokół wyjaśnia sposób izolacji, wentylacji i perfuzji płuc myszy. W celu umożliwienia wentylacji przeprowadzane jest chirurgiczne odsłonięcie tchawicy.

Następnie izoluje się serce i płuca, aby umożliwić kaniulację tętnicy płucnej i lewego przedsionka. Następnie przeprowadzana jest perfuzja układu płucnego. Eksperymenty wykonuje się poprzez zmianę przepływu w tętnicy płucnej, jego amplitudy, kształtu fali lub częstotliwości.

Otrzymane przebiegi fal ciśnienia w tętnicy płucnej i lewym przedsionku są rejestrowane i obrazują pulsacyjne zależności między ciśnieniem a przepływem w płucach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak preparaty in vivo, jest to, że pulsacyjne zależności między ciśnieniem a przepływem można uzyskać bez wpływu zmian stanu objętościowego, napięcia współczulnego układu nerwowego, aktywności oraz efektów znieczulenia.

Ponadto większość izolowanych preparatów płuc mierzy jedynie stacjonarne zależności między ciśnieniem a przepływem, podczas gdy nasza technika pozwala na wyznaczenie pulsacyjnych zależności ciśnienia i przepływu. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu fizjologii płuc, takie jak: w jaki sposób choroby naczyniowe płuc wpływają na pulsacyjną hemodynamikę płucną lub jak zwiększona sztywność tętnicy płucnej wpływa na obciążenie następcze prawej komory? Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ odsłonięcie serca i płuc oraz zabezpieczenie kaniuli w tętnicy płucnej są trudne do opanowania.

Nadmierne ciśnienie generowane przez aparaturę może spowodować obrzęk płuc, a nieprawidłowe umieszczenie kaniuli może doprowadzić do przebicia tętnicy płucnej. Przed rozpoczęciem eksperymentu konieczne jest przygotowanie systemu IL one, służącego do wentylacji i perfuzji izolowanego płuca. Przewody należy podłączyć do przetworników ciśnienia.

Przy użyciu pojedynczej pompy i przepływomierza całkowicie przepłucz system wodą destylowaną podgrzaną do 37 °C i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z drenów. Następnie nasyć dreny pompy Endur tech 1% PBS. Teraz wyzeruj urządzenie.

Zmierz ciśnienie dla każdego przetwornika P 75, najpierw zamykając jego zawór prowadzący do układu IL one, a następnie otwierając zawór prowadzący do atmosfery. Następnie użyj wzmacniacza plug SIS, aby automatycznie wyzerować ciśnienie. Przed przygotowaniem zwierzęcia nawilż zestaw IO one, namaczając ceramiczny element porowaty w wodzie destylowanej. Po znieczuleniu myszy ustabilizuj ją do operacji, przypinając przednie łapy do korkowej tablicy.

Następnie spryskaj klatkę piersiową 95% alkoholami. Użyj pęsety prostej, aby chwycić skórę w okolicy szyi i wykonaj otwór o szerokości jednego centymetra za pomocą nożyczek prostych. Po odsłonięciu wnętrza szyi wytnij białą tkankę gruczołową w mięśniach powierzchownych, poszukując przełyku i tchawicy.

Wyizolować przełyk i tchawicę z otaczających je tkanek po obu stronach oraz od strony grzbietowej i zawiązać luźny szew wokół tchawicy. Aby przeprowadzić kaniulację tchawicy, ostrożnie wyciąć niewielkie nacięcie w kształcie litery V w jednej z jej ścian za pomocą małych nożyczek. Następnie przenieść mysz do systemu IL one, używając pęsety tępiej.

Chwyć kaniulę tchawiczą i wprowadź ją do tchawicy. Zabezpiecz kaniulę szwem. Rozpocznij wentylację najpierw powietrzem atmosferycznym, spryskaj klatkę piersiową alkoholem, a następnie usuń skórę za pomocą pęsety prostej i nożyczek prostych.

Nacinamy skórę w górę wzdłuż mostka. Unosimy skórę po obu stronach i nacinamy ją wzdłuż linii dolnych żeber. Następnie chwytamy pęsetą wyrostek xifoideus i za pomocą nożyczek z tępym czubkiem wycinamy otwór w przeponie w miejscu, w którym styka się ona z dolną częścią mostka.

Chwyć przeponę i odetnij ją od żeber. Używając nożyczek z tępymi końcami, ponownie uchwyć wyrostek mieczowaty i ostrożnie przetnij mostek przez żebra, nie uszkadzając płuc, serca ani naczyń krwionośnych. Aby odsłonić serce, chwyć lewe żebra i odetnij ich końce.

Teraz powoli wstrzyknij do prawej komory 0.1 milliliters heparyny. Po zastrzyku odetnij pozostałe żebra. Używając grzbietowej lub zaokrąglonej końcówki pęsety, delikatnie odsuwaj płuca od żebra podczas ich wycinania pod mikroskopem. Usuń tkankę gruczołową znajdującą się w tłuszczu na powierzchni serca.

Używając pęsety, odsunąć tkanki i je przyciąć. Przy pomocy nożyczek sprężynowych nałożyć szew wokół aorty i tętnicy płucnej, delikatnie podważając serce tępą pęsetą. Opór powinien być niewielki.

Teraz zawiąż luźny szew za pomocą podwójnego splotu. Następnie odetnij dolną część brzucha. Używając nożyczek kątowych, przetnij żebra i kręgosłup.

Spowoduje to znaczny krwotok. Należy użyć patyczka higienicznego, aby zahamować krwawienie. Po zatrzymaniu przepływu krwi, należy przepłukać system IL czterema mililitrami RPMI za pomocą strzykawki wypełnionej 10 mililitrami RPMI.

Warto upewnić się, że w przewodzie nie ma pęcherzyków powietrza. Teraz należy przeprowadzić kaniulację prawej komory, wycinając niewielką szczelinę w pobliżu wierzchołka i wprowadzając kaniulę. Należy skierować ją w dół do prawej komory, aby dotrzeć do tętnicy płucnej. Końcówka sondy powinna być widoczna przez niemal przezroczystą ścianę tętnicy płucnej.

Następnie zaciśnij szew wokół kaniuli, aorty i tętnicy płucnej, aby przeprowadzić kaniulację lewej komory. Wytnij nacięcie w wierzchołku i wprowadź kaniulę, kierując ją w górę w stronę lewego przedsionka. Może być konieczny lekki nacisk, aby zlokalizować zastawkę, ale po jej znalezieniu kaniula prześlizgnie się przez nią i zostanie zabezpieczona bez konieczności stosowania szwu.

Ręcznie podawaj medium RPMI z strzykawki 10 ml z prędkością 0,3 ml na minutę, aż pojawi się przepływ w przewodzie odpływowym. Jeśli w przewodzie odpływowym nie ma przepływu, skoryguj położenie kaniuli lewej komory. Jeśli jednak w płucach nie ma przepływu, przerwij eksperyment, ponieważ prawdopodobnie występuje nieszczelność tętnicy płucnej.

Po pełnym zakanulowaniu serca, podłącz strzykawkę o pojemności 60 ml do systemu IL 1. Używając pompy do stałego przepływu, wprowadź RPMI Perfuse 8 z prędkością 1 ml na minutę. Podczas wstępnej perfuzji sprawdź, czy nie występują wycieki.

Stopniowo perfunduj płuca przez kolejne dwie minuty, podczas których płuca zmienią kolor na biały. W przypadku badań przepływu pulsacyjnego najpierw ustaw przemieszczenie tłoka pojedynczej pompy na pożądanych poziomach.

Następnie ustaw stałą szybkość przepływu. Teraz otwórz zawór do pompy osli i rozpocznij rejestrację danych bezpośrednio przed uruchomieniem profilu przepływu osli. Po zakończeniu otwórz plik wyjściowy danych i wykreśl przepływ eksperymentalny na podstawie przepływów eksperymentalnych z próby wstępnej.

Dostosuj skok tłoka pompy oscylacyjnej przy każdej częstotliwości tak, aby wartość Q max była zgodna z założeniami. Utrzymuj wentylację przy stałym ciśnieniu. Podczas gromadzenia danych dla prób przepływu stacjonarnego zamknij zawór prowadzący do pompy solitarnej i ustaw prędkość przepływu stacjonarnego na pożądanym poziomie. Rozpocznij rejestrację danych i wykonaj kolejne kroki protokołu przepływu stacjonarnego.

Zbieraj dane przez co najmniej 10 s dla każdego przepływu pomiędzy próbami. Przywróć przepływ do wartości 0,5 ml/min. Należy upewnić się, że podczas zbierania danych wentylacja odbywa się pod stałym ciśnieniem.

Jeśli wymagane są próby z zerowym ciśnieniem w lewym przedsionku, należy usunąć dren odpływowy podczas ich przeprowadzania. Należy uważnie monitorować, czy pożywka RPMI nie przedostaje się do drenu dróg oddechowych. Nie wolno dopuścić do dostania się RPMI do przetworników ciśnienia w drogach oddechowych, ponieważ uległyby one uszkodzeniu.

Poniżej przedstawiono wyniki perfuzji o stałym przepływie z przepływem Q w górnym rzędzie oraz wynikającymi z niego ciśnieniami w tętnicy płucnej i lewym przedsionku w drugim rzędzie w różnych warunkach. W dwóch pierwszych panelach ciśnienie w lewym przedsionku wzrastało i spadało wraz z Q, ponieważ zastosowano dren odpływowy; pierwszy panel przedstawia ciśnienie powietrza w końcowej fazie wdechu, a drugi ciśnienie powietrza w końcowej fazie wydechu. Następnie usunięto dren, tak aby ciśnienie w lewym przedsionku było stałe i niezależne od Q. Potem ręcznie dostosowano wysokość drenu odpływowego w taki sposób, aby ciśnienie w lewym przedsionku było wyższe.

Niezależnie od Q, na pierwszym panelu przedstawiono ciśnienie powietrza na końcu wdechu (ciśnienie inspiracyjne), a na drugim ciśnienie powietrza na końcu wydechu (ciśnienie ekspiracyjne). Wynikowe, ustalone zależności między ciśnieniem a przepływem w tętnicy płucnej dla każdego przypadku można uzyskać, wykreślając ciśnienie w funkcji przepływu.

Poniżej przedstawiono wyniki perfuzji z przepływem pulsującym, gdzie w górnym panelu ukazano przepływ Q oraz wynikające z niego ciśnienia w tętnicy płucnej, lewym przedsionku i w powietrzu. W dolnym panelu zaprezentowano zależności między pulsującym ciśnieniem płucnym a przepływem, na podstawie których można obliczyć impedancję naczyniową płuc, odzwierciedlającą całkowite obciążenie następcze prawej komory.

Po opanowaniu tej techniki procedura ta zajmuje od 20 do 30 minut. Podczas jej wykonywania ważne jest, aby nie spieszyć się i zachować spokój, co zapewni stabilność dłoni. Gdy płuca zostaną odpowiednio ukrwione, najtrudniejszy etap jest już za nami.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne techniki, takie jak histologia lub analizy biochemiczne tkanki płucnej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, jakie mechanizmy molekularne odpowiadają za obserwowane zmiany w relacjach między pulsacyjnym przepływem a ciśnieniem w płucach. Technika ta otwiera drogę badaczom z dziedziny fizjologii płuc do zgłębiania roli konkretnych genów i białek w rozwoju i progresji chorób naczyniowych płuc z wykorzystaniem genetycznie zmodyfikowanych myszy.