Oznaczanie potencjału błony mitochondrialnej i reaktywnych form tlenu w żywych neuronach korowych szczura

Celem niniejszej procedury jest oznaczenie potencjału błony mitochondrialnej oraz poziomu reaktywnych form tlenu w pierwotnych neuronach korowych z wykorzystaniem sond fluorescencyjnych odpowiednio TMRM oraz H 2D CFD. Procedurę tę realizuje się poprzez przygotowanie roztworów stokowych i roboczych TMRM oraz H 2D CFDA. W drugim kroku neurony korowe inkubuje się z TMRM i H 2D CFDA w temperaturze pokojowej przez 45 minut w buforze Thai roads.

Trzecim krokiem jest obrazowanie intensywności fluorescencji TMRM i DCF w żywych neuronach korowych, wykorzystując odpowiednio wzbudzenie i emisję 515/517 nm oraz 488/515 nm. Zmiany w fluorescencji TMR będą monitorowane w obecności mitochondrialnego odsprzęgacza FCCP, natomiast zmiany w fluorescencji DCF będą monitorowane w obecności nadtlenku wodoru. Ostatnim etapem tej procedury jest gromadzenie, normalizacja i analiza danych.

Ostatecznie wyniki uzyskuje się poprzez wykreślenie wykresu przedstawiającego względne poziomy intensywności fluorescencji TMRM oraz DCF odpowiednio przed i po traktowaniu FCCP oraz nadtlenkiem wodoru. Witam, nazywam się Joanna Koska. Zapraszam do mojego laboratorium na Uniwersytecie Loyola w Chicago.

Dzisiaj pokażemy Państwu, jak mierzyć potencjał błony mitochondrialnej oraz ilości reaktywnych form tlenu w neuronach korowych szczura. Procedurę zaprezentuje dhi. Witam, jestem Denise Jossi.

Stosując tę procedurę, można zmierzyć potencjał błony mitochondrialnej przy użyciu markera pojedynczych mitochondriów oraz poziom reaktywnych form tlenu przy użyciu markera pojedynczych komórek. Przejdźmy zatem do części praktycznej. Przygotuj roztwór stokowy TMRM o stężeniu 10 mM, rozpuszczając 5 mg TMRM w 1 ml bezwodnego dimetylosulfotlenku, a następnie mieszaj w wortexie przez jedną minutę.

Następnie przygotować alikwoty i przechowywać je w temperaturze -20 °C. Chronić przed światłem i zużyć w ciągu jednego miesiąca. Następnie przygotować 10 mM roztwór zapasu H 2D CFDA, rozpuszczając 4,87 mg H 2D CFDA w 1 ml bezwodnego dimetylosulfotlenku.

Analogicznie, mieszaj w wirówce typu vortex przez jedną minutę, następnie przygotuj aliquoty i przechowuj je w temperaturze -20°C. Chronić przed światłem i zużyć w ciągu jednego tygodnia do wstępnego ładowania neuronów kory szczura TMRM. Przemyj hodowane neurony trzy razy buforem Tyro'a.

Następnie przygotuj 20 nM TMRM, rozcieńczając 10 mM roztwór zapasowy TMRM 1000-krotnie w tb. Następnie dodaj 2 µL rozcieńczonego TMRM na każdy 1 mL tb. Inkubuj neurony z TMRM przez 45 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.

Po 45 minutach umieść szalkę z hodowlą na stoliku mikroskopu i rozpocznij obrazowanie, aby załadować neurony kory szczura z H 2D CFDA, a następnie trzy razy przemyj hodowlone neurony w tb. Następnie przygotuj 2 µM H 2D CFDA, rozcieńczając 10 mM roztwór stokowy H 2D CFDA 10-krotnie w tb. a następnie dodaj 2 µL rozcieńczonego H 2D CFDA na każdy 1 mL tb.

Następnie inkubować neurony z H 2D CFDA przez 45 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Po 45 minutach przemyć neurony czterokrotnie buforem TB, aby usunąć nadmiar wskaźnika fluorescencyjnego, przed wykonaniem obrazowania na żywo neuronów inkubowanych z TMRM przy użyciu konfokalnej skanującej mikroskopii laserowej z zastosowaniem programu do serii czasowych obrazowania na żywo. Stosować niską rozdzielczość oraz osłabioną moc lasera, aby zminimalizować czas potrzebny na uzyskanie obrazów i uniknąć fotoblaknięcia.

Następnie, przy użyciu światła odbitego, ustaw ostrość obrazu zamontowanych neuronów obciążonych TMRM. Przeanalizuj fluorescencję TMRM, stosując wzbudzenie przy 540 nanometrach i detekcję przy 570 nanometrach. Po ustawieniu wszystkich parametrów, w tym rozdzielczości, mocy lasera, wzmocnienia kamery oraz interwału odstępów czasowych dla obrazowania, ustaw wzmocnienie detekcji kamery tuż poniżej poziomu nasycenia.

Nie należy zmieniać tych ustawień pomiędzy eksperymentami. Następnie należy zmienić pole. Rozpocznij zbieranie obrazów, aby przetestować zmiany w bodźcu delta PSY M; można zastosować np. 1 µM FCCP lub 2 µg/mL oligomycyny, co odpowiednio spowoduje znaczną depolaryzację lub hiperpolaryzację potencjału błony mitochondrialnej.

Zmiany te będą objawiać się spadkiem intensywności fluorescencji TMRM w porównaniu z bazową intensywnością fluorescencji w przypadku zastosowania FCCP lub wzrostem intensywności fluorescencji TMRM. W przypadku LIGA myin sin, aby przeprowadzić obrazowanie na żywo neuronów inkubowanych z H 2D CFDA, należy najpierw umieścić szalkę hodowlaną na stoliku mikroskopu, a następnie ustawić ostrość obrazu komórek, korzystając ze światła odbitego. Fluorescencję DCF należy badać przy wzbudzeniu 4 88 nanometrów i emisji 5 15 nanometrów.

Następnie ustaw moc lasera na poziom od 5% do 7%, ustaw wzmocnienie (gain) oraz rozdzielczość 256 na 256. Nie zmieniaj tych ustawień pomiędzy eksperymentami. Następnie ustaw częstotliwość pozyskiwania obrazów na żywo.

Korzystając z programu serii czasowych, wybierz nowe pole i rozpocznij akwizycję obrazów w celu wykrycia zmian poziomu R os. Potraktuj komórki stężeniem od 100 do 200 µM nadtlenku wodoru. Przejawi się to wzrostem intensywności fluorescencji DCF w porównaniu z poziomem bazowym.

Użyj narzędzia wyznaczania obszaru zainteresowania (ROI) z programu LSM, aby wybrać odpowiednie obszary. Następnie wybierz ROI z regionów mitochondrialnych lub ROI z całego ciała komórki na obrazach komórek. Służy to do pomiaru intensywności fluorescencji odpowiednio dla TMRM lub ROS.

Wybierz obszary obok komórek. W celu obliczenia intensywności fluorescencji tła wykonaj kilka pomiarów, a następnie, aby obliczyć średnią intensywność tła, odejmij średnią intensywność fluorescencji tła od średnich intensywności fluorescencji obszarów zainteresowania w każdej komórce dla każdego punktu czasowego, korzystając z programu Microsoft Excel. Po odjęciu intensywności tła znormalizuj intensywność fluorescencji TMRM lub DCF do fluorescencji bazowej.

Korzystając z tego wzoru, użyj programu SigmaPlot, aby wygenerować wykres przedstawiający zmiany intensywności fluorescencji w czasie. Oto przykład obrazu fluorescencyjnego neuronów kory mózgu szczura inkubowanych z TMRM. Dodanie mitochondrialnego odsprzęgacza F-C-C-P-A prowadzi do depolaryzacji mitochondriów i utraty intensywności fluorescencji TMRM.

Poziom fluorescencji TMRM w stanie wyjściowym pozostaje stabilny przed dodaniem FCCP. Analiza ilościowa zmian fluorescencji TMRM w czasie wykazuje znaczący spadek fluorescencji TMRM po dodaniu FCCP. Oto przykład obrazu fluorescencyjnego neuronów kory mózgu szczura z obciążeniem DCF.

Poziom bazowej fluorescencji DCF pozostaje bez zmian w ciągu pierwszych 120 sekund przed zastosowaniem nadtlenku wodoru. Dodanie nadtlenku wodoru skutkuje wzrostem intensywności fluorescencji DCF w ciałach komórek. Pomiary fluorescencji DCF w czasie (time-lapse) wykazują jej stabilne poziomy, które wzrosły po zastosowaniu nadtlenku wodoru.

W tej procedurze ważne jest pamiętanie o zastosowaniu niskiej mocy lasera oraz szybkiej prędkości skanowania, aby uniknąć artefaktów wynikających z fotoblaknięcia i fototoksyczności. Powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.