Siedem kroków do uzyskania komórek gwiaździstych

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek gwiaździstych wątroby z wątroby mysiej. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie w pierwszej kolejności dwóch perfuzji wątrób mysich enzymami trawiennymi. Po perfuzji wątroby są cięte na małe kawałki w celu zwiększenia wydajności trawienia in vitro, które jest wykonywane w kolejnym kroku.

W ostatnim kroku komórki gwiaździste wątroby są oddzielane od innych typów komórek wątroby za pomocą wirowania w gradiencie gęstości. W rezultacie uzyskuje się komórki gwiaździste wątroby, a ich czystość można ocenić za pomocą mikroskopii świetlnej i immunofluorescencyjnej. Procedurę zademonstruje Patrick Meyer, doktorant z laboratorium. W ramach przygotowania do perfuzji wątrób mysich w roztworze NC dwa, należy najpierw ogrzać bufor SC jeden oraz roztwory perfuzyjne z enzymami w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.

Następnie należy ustawić pompę perystaltyczną tak, aby uzyskać przepływ laminarny wynoszący 6.5 milliliters per minute i zrównoważyć rurkę silikonową pompy roztworem SC one. Teraz należy potwierdzić brak odruchów, aby upewnić się, że znieczulona mysz znajduje się w głębokiej sedacji. Następnie mysz należy unieruchomić w pozycji grzbietowej na odpowiedniej podstawie.

Używając nożyczek i pęsety, wykonaj nacięcie podłużne skóry brzusznej i odsłoń otrzewną. Ostrożnie otwórz otrzewną i przesuń jelita z jamy brzusznej na lewą stronę zwierzęcia, aby odsłonić żyłę wrotną. Najtrudniejszym elementem tej procedury jest perfuzja wątroby enzymami trawiennymi, która zostanie teraz zademonstrowana.

Następnie, podczas wprowadzania kaniuli oraz monitorowania zmian w strukturach wątroby w trakcie perfuzji, ważne jest korzystanie ze stereomikroskopu. Pracując pod stereomikroskopem, wprowadź kaniulę zestawu infuzyjnego do żyły wrotnej. Rozpocznij perfuzję wątroby 30 mililitrami roztworu SC one. Natychmiast po uruchomieniu przepływu otwórz żyłę główną dolną.

Prawidłowe przepłukanie wątroby objawia się utratą barwy tkanki wątrobowej; następnie przemyj wątrobę 30 mililitrami roztworu Pronase E. Po perfuzji roztworem pronazy E płaty wątroby obrzękną, a zraziki staną się wyraźnie widoczne przez torebkę; następnie przeprowadź perfuzję 30 mililitrami roztworu kollagenazy P. Po zakończeniu perfuzji kollagenazą P pobierz wątrobę z myszy, ostrożnie oddzielając ją od przepony i sąsiednich organów, a następnie umieść ją w 70 mililitrach roztworu SC two na lodzie.

W tym momencie wątroba straciła swój kształt i wygląda na wiotką oraz amorficzną. Procedura trawienia wątrób mysich powinna być przeprowadzana w warunkach sterylnych, w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

Za pomocą ostrych nożyczek należy pociąć wątroby na kawałki o wymiarach około 2 × 2 × 2 mm³. Następnie zawiesinę 70 ml SC dwa oraz kawałki wątroby należy połączyć z 50 ml roztworu proteazy E i kolagenazy P. Po dodaniu 1 ml roztworu dna jeden, wątroby należy trawić przez 20 minut w temperaturze 37 °C przy jednoczesnym mieszaniu.

Po trawieniu enzymatycznym tkanki wątroby komórki gwiaździste są oddzielane od innych typów komórek wątrobowych za pomocą wirowania w gradiencie gęstości. Aby rozpocząć tę procedurę, przefiltruj zawiesinę komórkową przez sita komórkowe o rozmiarze 70 µm do sześciu probówek Falcon o pojemności 50 mL i przemyj komórki buforem E2, a następnie wiruj przez 10 minut przy 600 ×g w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu ostrożnie odessij 40 mL supernatantu z każdej probówki.

Następnie do każdej probówki dodaj 150 µL roztworu DNA i resuspenduj komórki. Połącz zawiesiny komórkowe w czterech probówkach Falcon o pojemności 50 mL i przemyj za pomocą wirówki w buforze G-B-S-S-P przez 10 minut przy 600 ×g i 4 °C. Ostrożnie odessij jak najwięcej supernatantu, uważając, aby nie naruszyć osadu, a następnie do każdej probówki dodaj 150 µL roztworu DNA.

Osady komórkowe resuspendujemy w 10 mililitrach G-B-S-S-B na probówkę. Komórki łączymy w dwóch 50-mililitrowych probówkach typu Falcon i dopełniamy G-B-S-S-B do całkowitej objętości 36 mililitrów na probówkę. Do każdej probówki dodajemy 14 mililitrów roztworu den i dokładnie mieszamy.

Następnie przenieś 10 mililitrów zawiesiny komórkowej do jednej probówki do wirowania gradientowego o pojemności 12 mililitrów, aż do uzyskania łącznie 10 probówek. Ostrożnie nałóż na zawiesinę komórkową 1,5 mililitra G-B-S-S-B na probówkę. Wirowanie gradientów przeprowadź przez 15 minut przy 1500 Gs i czterech stopniach Celsius bez hamowania.

Następnie hepatocyty osiądą na dnie probówki, natomiast komórki gwiaździste znajdą się na granicy faz w postaci białego pierścienia. Za pomocą pipety 5 ml ostrożnie pobierz frakcję z granicy faz zawierającą komórki gwiaździste i przenieś ją do probówki o pojemności 50 ml. Przemyj komórki, dodając G-B-S-S-B i wirując przez 10 minut przy 600 Gs w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odssać supernatant i resuspender komórki w 20 mililitrach DMEM z dodatkami. Po policzeniu komórek przenieść je do kolb hodowlanych w stężeniu 2 × 10⁴ komórek na centymetr kwadratowy; inkubować komórki w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla. Około dwóch godzin po przygotowaniu komórki gwiaździste wątroby powinny przywrzeć do podłoża; zmienić medium, aby wypłukać martwe komórki i resztki komórkowe.

Przenieś komórki z powrotem do inkubatora. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki przygotowania komórek gwiaździstych wątroby z wątrób mysich z zastosowaniem niniejszego protokołu. Komórki w pierwszym i trzecim dniu hodowli in vitro wykazują charakterystyczną morfologię komórek gwiaździstych wątroby. Mają one kształt astrocytoidalny i wykazują obecność pęcherzyków lipidowych.

W obrębie jąder komórkowych czystość wyizolowanych komórek gwiaździstych wątroby można również zweryfikować poprzez ekspresję gliałowego kwaśnego białka włóknistego (GFAP). Obrazy te przedstawiają reprezentacyjne barwienie immunofluorescencyjne na GFAP, zaznaczone kolorem czerwonym w komórkach gwiaździstych wątroby, które były hodowane przez trzy dni po izolacji komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak izolować komórki gwiaździste wątroby z wątroby neuronowej, aby uzyskać odpowiednią wydajność czystych komórek gwiaździstych.

Ważne jest zapewnienie efektywnego trawienia podczas perfuzji wątroby. Wreszcie, kluczowe jest określenie właściwej tożsamości wyizolowanych komórek poprzez ocenę morfologii i fenotypu komórek wątrobowych.