Wizualizacja naprawy błony komórkowej pośredniczonej przez MG53 z wykorzystaniem systemów in vivo i in vitro

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena zdolności do naprawy błony zarówno w organizmie zwierzęcia, jak i w izolowanych komórkach. Izolowane włókna mięśni szkieletowych są pobierane i otaczane pożywką zawierającą barwnik FM 1 43. Następnie wykorzystuje się laser UV do naświetlenia i uszkodzenia fragmentu błony komórkowej, aby umożliwić wniknięcie barwnika do wnętrza komórki.

Izolowane komórki są transfekowane plazmidowym DNA kodującym GFP MG 53, który lokalizuje się w błonie komórkowej oraz cytozolu komórki. Następnie końcówkę mikroelektrody wprowadza się do błony C two C 12 w celu wywołania uszkodzenia. W końcowym etapie można uzyskać wyniki wykazujące translokację GFP MG 53 do miejsca uszkodzenia.

Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ opanowanie technik penetracji mikroelektrodą i izolacji włókien mięśniowych wymaga odpowiedniej praktyki. Procedurę zaprezentują dr Lin, nasz kierownik laboratorium, dr Wazu, stażysta postdoc, Matt Orange, doktorant oraz dr Shaza, profesor asystent w naszym instytucie. Na początek należy umieścić tacę lub niebieską matę laboratoryjną pod bieżnią, aby zbierać odpady z organizmów zwierzęcych podczas eksperymentu.

Następnie ustaw kąt nachylenia powierzchni bieżni. Niektóre bieżnie posiadają wbudowany mechanizm do regulacji nachylenia, podczas gdy inne wymagają uniesienia bieżni za pomocą innych środków. Zazwyczaj stosuje się powierzchnię płaską lub kąt nachylenia od 7 do 15 stopni w dół lub w górę.

Aklimatyzuj myszy, umieszczając je na bieżni przy wyłączonej siatce elektrycznej i włączonym silniku napędowym taśmy, jednak bez jej ruchu, przez 15 minut; po okresie aklimatyzacji włącz motywacyjną siatkę elektryczną. Uruchom bieżnię z prędkością początkową wynoszącą około pięciu metrów na minutę. Zwiększając prędkość o jeden do dwóch metrów na minutę w każdej kolejnej minucie, zapewnij zwierzęciu pięciominutowy okres rozgrzewki.

Powtarzaj ten okres rozgrzewki codziennie przez okres od 3 do 10 dni, aby zwiększyć stopień współpracy podczas testów. W celu przeprowadzenia wysiłku do całkowitego wyczerpania, stopniowo zwiększaj prędkość bieżni, aż do osiągnięcia prędkości maksymalnej, monitorując wystąpienie oznak wyczerpania.

Zwierzę uznaje się za wyczerpane, gdy spędza więcej niż połowę czasu poza bieżnią lub pięć kolejnych sekund na kratce. Należy usunąć wyczerpaną mysz i zapisać całkowity czas biegu. Trening wytrzymałościowy.

Protokoły biegania rozpoczynają się od tej samej procedury rozgrzewki. Jednakże maksymalna prędkość jest zazwyczaj niższa, a czas biegu może być dość długi. Po zakończeniu testów należy przenieść myszy do ich klatki domowej i oczyścić bieżnię 70% etanolem.

Wyizoluj warstwę powierzchowną mięśnia zginacza krótkiego palców stopy w celu przeprowadzenia dalszej analizy. Najpierw naciągnij skórę podeszwy wzdłuż linii środkowej, uważając, aby nie uszkodzić znajdującego się pod nią mięśnia. Następnie wykonaj cięcia poziome i usuń skórę.

Zidentyfikuj płaski, biały ścięgno mięśnia FDB przyczepione do kości piętowej. Używając pęsety, odseparuj, a następnie przetnij ścięgno w pobliżu miejsca przyczepu. Delikatnie pociągnij ścięgno do góry, odcinając jednocześnie wszelką tkankę łączną.

Zlokalizuj miejsce, w którym ścięgna dystalne rozgałęziają się na poszczególne palce. Przetnij ścięgna w miejscu ich połączenia z głębszą warstwą mięśni i usuń FDB. Umieść pęczek mięśnia FDB w jednym mililitrze roztworu kolagenazy podgrzanego wcześniej do 37 °C.

Przyklej probówkę poziomo do inkubatora orbitalnego ustawionego na 37 °C i inkubuj przy 200 RPM przez 65 minut. Prawidłowe trawienie objawia się przeźroczystym wyglądem i bladym kolorem. Odetnij koniec końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby umożliwić przejście strawionego pęczka.

Przenieś wiązkę do probówki do wirowania zawierającej około 600 µL 2.5. Calcium tyro. Delikatnie odwróć probówkę, aby oddzielić luźne włókna od wiązki.

Następnie odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 30 µL w taki sposób, aby jej średnica była tylko nieco mniejsza od pęczka mięśniowego. Użyj tej końcówki, aby wciągnąć pęczek do pipety, a następnie wypchnąć go z powrotem do roztworu. Powtarzaj ten proces, aż większość włókien oddzieli się od pęczka.

Wymieszaj rozdzielone włókna, delikatnie obracając probówkę. Odlej pożądaną ilość i nanieś na szkiełko delta T z szklanym dnem. Pozostałe włókna przechowuj w temperaturze 4 °C przez około sześć godzin do wykorzystania w dalszych badaniach.

Pozostaw naczynie w spokoju przez pięć minut. Pozwoli to włóknom przytwierdzić się do szklanego dna naczynia. Umieść naczynie ze szklanym dnem w mikroskopie konfokalnym wyposażonym w laser UV.

Obserwuj włókna pod mikroskopem fazowym przy powiększeniu większym niż 100x, aby sprawdzić obecność prawidłowego wzorca prążkowania oraz prostego, prętożego kształtu. Dodaj do roztworu barwniki styroperineum FM 1 43 lub FM 4 64 do stężenia końcowego 2,5 micromolar. Ustaw włókno pod kątem 45 stopni, od lewego górnego do prawego dolnego rogu pola widzenia, aby wywołać uszkodzenie.

Naświetl obszar błony plazmatycznej o rozmiarach pięciu na pięć pikseli. Używając lasera UV ustawionego na maksymalną moc przez pięć sekund, naświetlony region powinien rozdzielić błonę plazmatyczną w taki sposób, aby połowa pola pięć na pięć znajdowała się wewnątrz włókna, a pozostała część na zewnątrz włókna. Przechwyć obrazy wnikania barwnika do włókna w odstępach pięciu sekund przez maksymalnie pięć minut. Na jednej płytce można naświetlić tylko trzy włókna, ponieważ barwnik fluorescencyjny zostanie ostatecznie endocytowany do włókna, co utrudni analizę danych.

Po wykorzystaniu trzech włókien należy przygotować nową szalkę. Używając oprogramowania analitycznego, oblicz zmianę intensywności fluorescencji w obszarze o powierzchni około 200 µm² w celu porównania włókien. Dla każdej klatki należy wykonać następujące obliczenie: delta F podzielone przez F zero, gdzie F zero to średnia fluorescencja obszaru zainteresowania w pierwszej przechwyconej klatce, a delta F to zmiana fluorescencji w każdej kolejnej klatce.

Zastosuj standardowe metody w celu transfekcji komórek plazmidowym DNA wykazującym ekspresję GFP MG 53. Następnie przygotuj mikropipety. Umieść kapilarę Pyrex na mikropipecie.

Wysuń i wciągnij zgodnie z zaprogramowanym ustawieniem. Przymocuj mikro-pipetę do trójosiowego mikromanipulatora kultury. Usuń pożywkę z tacki delta T i zastąp ją buforem tyrozynowym z 2.5 mM wapnia.

Umieść szalkę zawierającą transfektowane komórki na konfokalnym mikroskopie skaningowym z obiektywem imersyjnym olejowym 40 x 1.3 NA. Wywołaj ostre uszkodzenie żywej komórki, wprowadzając mikropipetę do błony komórkowej, a następnie szybko ją wycofując z komórki. Wykonaj sekwencyjne obrazy żywych komórek w odstępach 1,54 sekundy na klatkę w celu obserwacji zaburzeń błony indukowanych przez troponinę.

PERFUZOWANO 0,005% troponiny z prędkością około 1 ml/min bezpośrednio nad obrazowaną komórką. Bieżnia może być wykorzystana do pomiaru spadku wydolności biegowej. Przedstawione tutaj myszy z nokautem genu MG 53 wykazują obniżoną wydolność biegową z powodu uszkodzenia mięśni szkieletowych.

Zakres uszkodzeń spowodowanych przez laser UV zależy od zdolności do naprawy błony włókna. Przedstawiono tutaj włókno przed uszkodzeniem u myszy normalnej. Obraz ten został zarejestrowany 200 sekund później i pokazuje niewielkie uszkodzenie.

Włókno mięśniowe pochodzące od myszy z nokautem genu MG 53 o upośledzonej zdolności do naprawy błony wykaże znacznie większy wnikanie barwnika po zaobserwowaniu uszkodzenia. Oto przykład nieuszkodzonej miotubuli C2C12 przetransfekowanej GFP MG 53. Strzałka na tym obrazie wskazuje pęcherzyki zawierające GFP MG 53, które przemieszczają się w stronę miejsc uszkodzenia.

W tym przykładzie do uszkodzenia błony plazmatycznej wykorzystano saponinę. Należy zwrócić uwagę na translokację GFP MG 53 z cytozolu do błony komórkowej po wystąpieniu uszkodzenia. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby wyizolować wysokiej jakości włókna mięśniowe z gładkimi błonami sarkolemmalnymi i wyraźnym wzorem prążkowania.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat oceny zdolności do naprawy błony w mięśniach oraz hodowli komórkowej tych komórek.