Prosty protokół hodowli komórkowej metodą wiszącej kropli do generowania sferoidów 3D

Celem niniejszego eksperymentu jest wytworzenie trójwymiarowych struktur tkankowych przypominających steroidy. Osiąga się to poprzez najpierw zebranie hodowli komórkowych, a następnie przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek. Następnie krople zawiesiny komórkowej nanosi się na wewnętrzną stronę odwróconej pokrywki naczynia do hodowli tkanek.

Następnie pokrywkę odwraca się i nakłada na komorę nawilżania. Ostatnim krokiem jest inkubacja wiszących kropel przez 24 do 48 godzin w celu umożliwienia formowania się agregatów. Następnie można je przenieść do wytrząsanej kąpieli wodnej i inkubować przez kolejne pięć dni.

Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące różnice w kohezji agregatów lub sortowaniu komórek poprzez testy kondensacji, analizę symetrii powierzchni tkanki lub mikroskopię epifluorescencyjną. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak np. konwencjonalna hodowla tkankowa 2D, jest fakt, że komórki hodowane w 3D dokładniej naśladują oddziaływania międzykomórkowe występujące w środowisku tkankowym. Zaprezentuję tę metodę, aby pokazać, że jest ona na tyle prosta, iż poradzi sobie z nią nawet kierownik projektu.

Aby rozpocząć ten eksperyment, należy zebrać komórki adhezyjne przy 90% konfluencji. Najpierw odessać pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przepłukać warstwę komórek roztworem PBS. Następnie odessać PBS i nanieść pipetą 2 mL 0,05% roztworu trypsyny w EDTA na monowarstwę.

Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj do momentu odklejenia się komórek. Następnie wyjmij płytkę z inkubatora i przerwij proces trypsynizacji, dodając dwa mililitry pełnej pożywki.

Za pomocą pipety 5 ml należy utritrować mieszaninę, aż komórki zostaną całkowicie zawieszone. Następnie przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki 15 ml. Do zawiesiny komórkowej pipetować 40 µl roztworu DNA o stężeniu 10 mg/ml i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut po inkubacji.

Krótko wymieszaj zawiesinę komórkową za pomocą wortexa, a następnie odwiruj z prędkością 200 ×g przez pięć minut. Po zakończeniu wirowania odessij i odrzuć supernatant S, a następnie zawieś osad w 1 ml pełnej pożywki w celu przemycia. Powtórz wirowanie i ponownie zawieś osad w 1 ml pełnej pożywki.

Następnie wykonaj zliczanie komórek przy użyciu automatycznego licznika komórek lub hemosytometru. Doprowadź zawiesinę komórkową do końcowego stężenia 2,5 × 10⁶ komórek/ml, dodając odpowiednią ilość pożywki. Następnie przystąp do przygotowania kropel wiszących.

Przygotować komorę nawilżania, zdejmując pokrywkę z 60 milimetrowej szalki do hodowli tkanek i pipetując 5 ml PBS na dno szalki. Odwrócić pokrywkę szalki i nanieść pipetą do 20 kropli zawiesiny komórkowej o objętości 10 µl na jej wewnętrzną stronę. Należy upewnić się, że krople są rozmieszczone w wystarczających odstępach, aby się nie stykały.

Ostrożnie nałóż pokrywkę z kulturami w kropelkach z powrotem na dno naczynia zawierającego PBS. Umieść płytkę z hodowlą w inkubatorze do kultur tkankowych. Ustaw temperaturę na 37°C, stężenie dwutlenku węgla na 5% oraz wilgotność na 95% i inkubuj przez noc.

Monitoruj krople codziennie i kontynuuj inkubację do czasu utworzenia się arkuszy komórkowych lub agregatów. Po uformowaniu się arkuszy komórkowych lub agregatów przenieś je do szklanych kolb z wytrząsarką o okrągłym dnie zawierających 3 mL kompletnej pożywki. Inkubuj kolby z arkuszami komórkowymi lub agregatami w wodnej łaźni z wytrząsaniem.

Próbki utrzymywano w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla przez około 24 godziny, aż do momentu, gdy tworzenie się steroidów można było zaobserwować pod mikroskopem stereoskopowym. Po uformowaniu się steroidów wpływ manipulacji eksperymentalnych na ich powstawanie można określić ilościowo zgodnie z procedurą opisaną w protokole pisemnym. Ponadto w tym momencie można zwizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej interkalację w błonie wszelkich wcześniej dodanych barwników fluorescencyjnych.

Ten obraz z mikroskopu w świetle przechodzącym przedstawia agregację komórek raka prostaty szczura MLL po 18 godzinach inkubacji metodą wiszącej kropli. Obraz ten ukazuje drugi agregat komórek MLL utworzony po 18 godzinach hodowli metodą wiszącej kropli. Komórki te hodowano w obecności 25 µM inhibitora MEK PD 9 8 0 5 9, co doprowadziło do powstania znacznie bardziej zwartego agregatu komórek.

Tutaj przedstawiono różnicę w wielkości agregatów między hodowlą kropelkową MLL traktowaną inhibitorem MEK a wielkością agregatów w grupie kontrolnej nieleczonej. Gwiazdka oznacza statystycznie istotną różnicę przy P mniejszym niż 0,0001. Wynik ten, ustalony za pomocą testu t studenta pomiędzy agregatami nieleczonymi a traktowanymi inhibitorem MEK, sugeruje, że zastosowanie inhibitora MEK prowadzi do powstania znacznie mniejszych i bardziej zwartych agregatów.

Zdjęcie to zostało wykonane przy użyciu stereomikroskopu Nikon Smz 800 i przedstawia steroid powstały w wyniku inkubacji komórek zarodkowej wątroby kurczaka w kulturze kropel wiszących przez 18 godzin, a następnie w wytrząsanej łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. To obraz z mikroskopu konfokalnego demonstruje zachowanie sortowania, które występuje, gdy określone populacje komórek są współhodowane metodą kropel wiszących; przed przystąpieniem do hodowli w kropelach wiszących komórki zarodkowej wątroby kurczaka zabarwiono barwnikiem do powłok błonowych pkh two oraz zarodkowymi komórkami kurczaka.

Komórki serca zabarwiono barwnikiem PKH 26. Następnie zmieszano zawiesiny komórkowe i zastosowano metodę wiszącej kropli. Hodowla trwała 18 godzin, po czym nastąpiła 48-godzinna inkubacja w shaking water bath w temperaturze 37 degrees Celsius.

Na przekroju optycznym widać, że komórki serca zabarwione na żółto są otoczone przez komórki wątroby. Tutaj, w pseudokolorach niebieskich, znajdują się dwa klony komórek L przetransfekowanych, wykazujących obecność NCA na ich powierzchniach. W stosunku 2,4:1 zostały one zabarwione fluorescencyjnymi barwnikami do błon, PKH 2 i PK CH 26, zmieszanymi w równych proporcjach, a następnie hodowane w formie wiszących kropel, jak opisano wcześniej.

W tym przykładzie komórki wykazujące wysoką ekspresję kadheryny, zaznaczone pseudokolorem zielonym, są otoczone przez komórki wykazujące niższą ekspresję kadheryny, zaznaczone pseudokolorem czerwonym. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zająć 30 minut lub mniej.