Prosta i wydajna metoda izolacji makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłych osobników

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest uzyskanie wielu kultur makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby szczura bez konieczności stosowania złożonego sprzętu lub specjalistycznych umiejętności. Osiąga się to najpierw poprzez dysocjację komórek wątroby dorosłego szczura za pomocą perfuzji kolagenazą, a następnie poprzez izolację parenchymalnej frakcji hepatocytów. Następnie komórki inkubuje się w kolbach do hodowli tkankowej T 75 z pożywką wzrostową w celu ustanowienia mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby.

Następnie, po 10 do 12 dniach hodowli, kolby hodowlane są wstrząsane, aby ułatwić przeniesienie makrofagów do naczyń plastikowych, z których są one następnie zbierane poprzez selektywną adhezję po krótkim okresie inkubacji. W końcu, ponad 10 z sześciu komórek może być wielokrotnie zbieranych z tych samych kolb do hodowli tkanek T 75 w odstępach dwu- lub trzydniowych przez ponad dwa tygodnie. Metody izolacji makrofagów wątrobowych zostały dobrze opisane.

Większość wcześniejszych metod wymaga jednak zaawansowanego sprzętu, takiego jak wirówka do gradientów gęstości, oraz wysokich umiejętności technicznych. Przedstawiamy tutaj prostą i nowatorską metodę pozyskiwania makrofagów wątrobowych w wystarczającej liczbie i czystości z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłego osobnika, która nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani zaawansowanych umiejętności laboratoryjnych. Sekcja zwierząt, perfuzja wątroby oraz przygotowanie cytokin zostaną zaprezentowane przez dr. Norco, dr. Yamanakę i dr. Miko Yoshioka z Narodowego Instytutu Zdrowia Zwierząt.

Następnie dr Taketo Takeno z National Institute of Agro Biological Sciences zaprezentuje izolację i oczyszczanie makrofagów wątrobowych z hodowli. Zacznijmy zatem. W ramach przygotowań do perfuzji wątroby szczura należy uprzednio podgrzać jedną butelkę roztworu płuczącego oraz jedną butelkę roztworu kolagenazy.

Następnie, po potwierdzeniu sedacji za pomocą uszczypnięcia skóry, umieść znieczulonego dorosłego samca szczura w stalowej kuwecie i spryskaj jego brzuch oraz klatkę piersiową 70%etanolem. Następnie wykonaj niewielkie nacięcie w środkowej części brzucha za pomocą nożyczek sekcyjnych i odsunie skórę. Potem otwórz jamę brzuszną nożyczkami i potwierdź położenie żyły wrotnej.

Następnie przeprowadź nić chirurgiczną pod żyłą wrotną i luźno ją zaciśnij. Potem zaklempluj dystalną część żyły głównej dolnej oraz żyłę krezkową za pomocą kleszczyków typu mosquito, aby zapobiec cofaniu się krwi do wątroby. Otwórz jamę klatki piersiowej, przecinając przeponę nożyczkami, i odsłoń serce; po wykonaniu małego nacięcia w żyle wrotnej za pomocą nożyczek okulistycznych, wprowadź do żyły plastikowy cewnik o średnicy 2 mm i mocno zaciśnij nić wokół cewnika.

Napełnij system perfuzyjny uprzednio podgrzanym roztworem piorącym, a następnie podłącz go do cewnika. Rozpocznij perfuzję w C two z szybkością 10 milliliters per minute. Jednocześnie wykonaj nacięcie w ścianie prawego przedsionka za pomocą nożyczek rozczepnych.

Kontynuuj perfuzję przez 10 minut, następnie zmień roztwór perfuzyjny na roztwór kolagenazy i perfunduj przez 10 do 20 minut. Z prędkością 10 ml/min napełnij sterylny zlew 25 ml roztworem kolagenazy. Następnie wyjmij i ostrożnie umieść perfundowaną wątrobę w zlewie.

Rozdrobnij wątrobę nożyczkami na małe kawałki. Do otrzymanej zawiesiny komórkowej dodaj 75 mililitrów zimnego MEM. Po delikatnym pipetowaniu przefiltruj zawiesinę przez sito komórkowe o oczkach 100 mikrometrów.

Aby usunąć tkankę łączną z niestrawionych fragmentów tkanki, należy zebrać filtrat do probówek stożkowych o pojemności 50 ml. Przenieś filtrat do probówek stożkowych o pojemności 50 ml i przemyj komórki czterokrotnie, odwirując je najpierw z prędkością 50 G przez jedną minutę w temperaturze 4 °C. Po zatrzymaniu wirowania ostrożnie odlej supernatant, a następnie resuspenduj osad w zimnym MEM i odwiruj komórki ponownie po ostatnim przemyciu.

Resuspender komórki wątroby w medium wzrostowym. Następnie wysiać komórki do od pięciu do 10 flasks do hodowli tkankowej T 75 przy gęstości 6,7 × 10⁴ komórek na centymetr kwadratowy. Umieścić flasks z kulturą w inkubatorze i wymieniać medium wzrostowe co dwa do trzech dni.

Po jednym dniu hodowli hepatocyty miąższowe rozprzestrzeniają się na powierzchni kolby i wykazują typową wieloboczna morfologię przypominającą kamień kopalowy z jednym lub dwoma okrągłymi jądrami. W ciągu kilku dni hodowli hepatocyty miąższowe tracą morfologię komórek nabłonkowych i przekształcają się w bardziej spłaszczone komórki fibroblastyczne. Około szóstego dnia, w kontraście fazowym, zaczynają proliferować na warstwie komórek fibroblastycznych jasne, okrągłe komórki przypominające makrofagi. Wzrost komórek przypominających makrofagi osiąga maksymalny poziom około 12. dnia.

Liczba komórek podobnych do makrofagów spada około 19. dnia, gdy włóknista warstwa komórkowa zaczyna ulegać degeneracji. Dlatego około 7. do 10. dnia hodowli zawieszamy makrofagi, które namnożyły się na warstwie komórkowej, w pożywce hodowlanej poprzez wzajemne wstrząsanie kolb hodowlanych przez 30 minut po resuspensji makrofagów. Każdej z 100 milimetrowych plastikowych płytek nieprzeznaczonych do hodowli tkanek przelewamy pożywkę z dwóch kolb T 75.

Ponownie napełnij kolby hodowlane pożywką wzrostową i umieść je w inkubatorze. Inkubuj naczynia plastikowe przez 30 minut po okresie inkubacji, a następnie przemyj naczynia trzykrotnie, odsysając pożywkę i delikatnie płucząc naczynie plastikowe PBS, jak pokazano tutaj; już po 10 minutach od wysiania komórki macrofagopodobne przywierają do powierzchni naczynia, podczas gdy pozostałe zanieczyszczające komórki fibroblastyczne pozostają w zawiesinie. Po płukaniu PBS uzyskuje się wysoką czystość populacji makrofagów.

Jak widać na tej rycinie, komórki zyskują typową morfologię makrofagów po 40 minutach hodowli, a często obserwuje się komórki w stanie mitozy, co wskazują strzałki. Aby zebrać tę nową, wysoko oczyszczoną populację makrofagów, należy dodać jeden mililitr roztworu trip LE Express do przemytych komórek i umieścić naczynia z powrotem w inkubatorze na kolejne 10 minut. Po tym czasie inkubacji należy dodać dziewięć mililitrów pożywki wzrostowej, a następnie delikatnie zebrać przytwierdzone makrofagi za pomocą skrobaka do komórek, przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, odwirować i usunąć nadsącz.

Dodać jeden mililitr pożywki wzrostowej, rozbić resuspenderowane agregaty komórkowe na pojedyncze komórki poprzez intensywne pipetowanie, a następnie określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru, jak pokazano na tym wykresie; z kolby hodowlanej T 75 można wielokrotnie pobrać ponad 10⁶ komórek w odstępach dwu- lub trzydniowych przez ponad dwa tygodnie, co pozwala na uzyskanie całkowitej liczby komórek rzędu 10⁷ na kolbę hodowlaną T 75. Jak pokazano na tych obrazach, izolowane komórki poddano barwieniu immunologicznemu z użyciem przeciwciał monoklonalnych przeciwko antygenom makrofagów szczura, takim jak CD 68 lub ED 1 oraz CD 172a lub OX 41. Komórki te wykazywały właściwości funkcjonalne makrofagów, takie jak aktywna fagocytoza mikrokulek znakowanych FITC.

W niniejszym filmie przedstawiliśmy prostą i wydajną metodę pozyskiwania makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych dorosłych komórek wątroby czerwonej. Nasza procedura nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani zaawansowanych umiejętności, a jednocześnie pozwala na uzyskanie wystarczającej liczby czystych makrofagów, które można wielokrotnie pobierać z tej samej kultury. Metodę tę można zastosować również u innych gatunków ssaków.

Dziękujemy za obejrzenie filmu i życzymy powodzenia w przyszłych eksperymentach. Pozdrawiamy.