Zoptymalizowany protokół wydajnej transfekcji komórek dendrytycznych bez dojrzewania komórek

Ogólnym celem tej procedury jest wyciszenie ekspresji genu docelowego w komórkach DCS za pomocą transfekcji siRNA. Jest to realizowane poprzez wstępne zaprogramowanie urządzenia AM Maxin Nucleo. Drugim krokiem procedury jest zmieszanie komórek DCS z siRNA, a następnie przeniesienie otrzymanej zawiesiny komórkowej pipetą do modułów Nucleo QVE.

Trzecim krokiem procedury jest umieszczenie płytki w tacy urządzenia amaxa shuttle w celu rozpoczęcia procesu transfekcji. Ostatnim krokiem procedury jest zakażenie komórek wirusem, aby aktywować odpowiedź interferonową. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące wyciszenie genu za pomocą ilościowego R-T-P-C-R oraz analizy Western blotting.

Technika ta jest cenna w charakterystyce szlaków sygnałowych w komórkach dendrytycznych i może przyczynić się do rozwoju immunoterapii opartych na komórkach dendrytycznych. Aby zaprogramować system transportowy Maxon 96 well shuttle nucleo factor do transfekcji komórek dendrytycznych, otwórz nowy plik parametrów. Wybierz liczbę dołków, które zostaną wykorzystane do standardowej transfekcji, przeciągając kursor po schemacie płytki 96-dołkowej.

Do każdej próbki doświadczalnej należy użyć co najmniej trzech studzienek do łączenia. Następnie należy wprowadzić kod programu: w części pierwszej wybrać F, F, a w części drugiej wybrać 1 68 z menu rozwijanego. Następnie z pola wyboru roztworu należy wybrać monocyte human, a w opcji kontroli wybrać standard, po czym kliknąć apply.

Aby uwzględnić kontrolę bez transfekcji, należy wybrać dodatkowe studzienki z diagramu. Następnie z opcji kontroli należy wybrać kontrolę bez programu i ponownie kliknąć zastosuj. Po wymieszaniu roztworu do nukleofekcji należy pozwolić mu ogrzać się do temperatury pokojowej.

Umieść wymaganą liczbę modułów nucleo vete w płytce nucleo VETE w odpowiedniej orientacji, wkładając pierwszy z nich do rzędów jeden i dwa, a następnie powtarzając czynność dla wszystkich kolejnych probówek. Przenieś z kolby do hodowli komórkowej do probówki o pojemności 50 ml odpowiednią ilość komórek DCS, aby uzyskać 500 000 komórek na dołek do transfekcji. Wirowarkuj komórki przez 10 minut przy 400 G w temperaturze 4°C, a następnie ostrożnie usuń nadsącz. Następnie dodaj do probówki roztwór do nukleofekcji i resuspenduj komórki DCS, delikatnie pipetując zawiesinę kilka razy w górę i w dół.

Teraz należy opisać probówki DPH zgodnie z konkretną procedurą, która ma zostać wykonana, a następnie rozdzielić resuspenderowane komórki do opisanych probówek. Do odpowiednich probówek należy dodać siRNA w końcowym stężeniu 0,25 µg na 500 000 komórek, a następnie wymieszać zawiesiny komórkowe za pomocą pipetowania. W próbce kontrolnej bez transfekcji należy zastosować nietargetowe siRNA.

Następnie pipetujemy 20 µL zawiesiny komórek SI RA DC do modułów NucleoVet zgodnie z wcześniej zaprogramowanym układem eksperymentalnym, upewniając się, że ciecz została dostarczona na dno studni; przykrywamy płytkę NucleoVet pokrywką i kilka razy uderzamy płytką o twardą powierzchnię, aby ułatwić usunięcie pęcherzyków powietrza w celu transfekcji komórek DC. Wkładamy przygotowaną płytkę NucleoVet do tacy zasuwczej NucleoEffector 96-dołkowej. Następnie klikamy przycisk „upload and start”.

Monitor postęp procesu transfekcji na wyświetlaczu. Czarny krzyżyk na zielonym tle oznacza pomyślną transfekcję w danej studzience, natomiast czarny pasek na czerwonym tle oznacza niepowodzenie w trakcie transfekcji komórek. Po zakończeniu procesu transfekcji podgrzej pożywkę wzrostową DC, wyjmij płytkę i dodaj 80 µL podgrzanej pożywki wzrostowej DC do każdej studzienki.

Używając pipety wielokanałowej, inkubuj teraz płytkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2. W czasie inkubacji dodaj 100 µL podgrzanego wcześniej medium wzrostowego DC do probówek matrycowych, zachowując tę samą orientację co w przypadku przygotowania płytki z kuwetami Nucleo. Po zakończeniu inkubacji przenieś całe 100 µL zawiesiny komórkowej z kuwet Nucleo CVE do wcześniej przygotowanych probówek matrycowych.

Następnie należy usunąć i zutylizować probówki, w których nie doszło do transfekcji. Na koniec inkubować probówki z macierzą przez 24 godziny lub w innym wybranym przedziale czasowym. Przygotować etykiety dla każdej z inkubowanych probówek z macierzą.

Następnie przenieś probówki matrycowe z inkubatora do komory z laminarnym przepływem powietrza i połącz probówki matrycowe dla każdej próbki doświadczalnej w uprzednio oznakowanych probówkach eend dfs. Następnie delikatnie zwirowuj komórki, wirując probówki eend DPH w wirówce laboratoryjnej przez 10 minut. Przy 400 G usuń snat i delikatnie resuspenduj komórki w bezsurowiczym medium wzrostowym zawierającym wirusa choroby Nowego Zamku lub NDV przy MOI równym 1.

Przykryj epi endorphins w sposób sterylny, a następnie inkubuj probówki przez 45 minut. Po tym czasie inkubacji dodaj 900 µl pożywki wzrostowej do DC i inkubuj probówki przez kolejne osiem do 10 godzin, aby zebrać przetransfekowane i zainfekowane DC.

Odwirować komórki w probówkach typu einor w wirówce stołowej, tak jak wcześniej, a następnie usunąć supernatant. Monocyty dcs zostały przetransfekowane albo siRNA celującym w RIG I, albo niespecyficznym glow irna, a następnie zainfekowane NDV (oznaczone znakiem plus) lub pozostawione niezinfekowane (oznaczone znakiem minus), co zdetekowano za pomocą ilościowej R-T-P-C-R. Zaobserwowano knockdown R RGA o 75% na poziomie transkrypcji; podobną redukcję odnotowano w ekspresji interferonu beta. Zaobserwowano również wpływ na efektor downstream RGA w kaskadzie sygnalizacyjnej interferonu. Ponadto, w niezinfekowanych komórkach kontrolnych po transfekcji nie wykryto ekspresji interferonu beta.

Podczas gdy w przypadku MXA oraz genu odpowiedzi w dół dla interferonu beta była ona minimalna. Tutaj przedstawiono dane z drugiej transfekcji komórek DCS za pomocą siRNA ukierunkowanego na RIG-I, przeprowadzonej analogicznie do poprzedniej postaci. Jednak w tym eksperymencie wszystkie komórki zostały zainfekowane NDV, a dodatkowo włączono kontrolę z wykorzystaniem niepoddanych resekcji monocytowych komórek DCS.

Wyniki wyciszania genów były podobne do tych zaobserwowanych na poprzedniej rycinie. Western blot przeprowadzony w celu wykrycia RGA wykazał, że ekspresja białka tego genu została całkowicie zablokowana. Ścieżki pierwsza i druga przedstawiają dane dla lizatów z komórek niepoddanych resekcji.

Ścieżki trzecia i czwarta przedstawiają lizaty z komórek transfekowanych glow irna, a ścieżki piąta i szósta przedstawiają lizaty z komórek transfekowanych S irna nakierowanym na RIG I. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu jednej godziny, wliczając w to jednoczesne wyciszanie wielu genów.