Generowanie i znakowanie nanocząsteczkami kropek kwantowych komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego myszy na potrzeby badań śledzących
2 czerwca 2011
Komórki dendrytyczne pobierają antygeny i migrują w stronę organów odpornościowych, aby zaprezentować przetworzone antygeny limfocytom T. Markowanie nanokryształami Qdot zapewnia długotrwały i stabilny sygnał fluorescencyjny. Umożliwia to śledzenie komórek dendrytycznych w różnych organach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie komórek dendrytycznych do badań obrazowych z wykorzystaniem nanokryształów kropek kwantowych (Q dot). Jest to realizowane poprzez wstępną izolację komórek szpiku kostnego z mostka, kości udowych i piszczeli. Następnie tworzone są hodowle komórek szpiku kostnego w celu umożliwienia różnicowania komórek w komórki dendrytyczne w obecności GM CSF.
Następnie, po ośmiu dniach, z hodowli komórek szpiku kostnego odzyskuje się komórki dendrytyczne. Ostatnim krokiem procedury jest barwienie komórek fluorescencyjnymi nanokryształami Q. W rezultacie jasno zabarwione komórki dendrytyczne można wizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Główną zaletą zastosowania tej technologii w porównaniu z innymi metodami, takimi jak użycie komórek dendrytycznych z tagiem GFP, jest fakt, że nanokryształy kropek kwantowych zachowują fluorescencję nawet po barwieniu rozpuszczalnikami organicznymi, takimi jak aceton. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania biologów zajmujących się komórkami dendrytycznymi, np. dotyczące właściwości migracyjnych tych komórek w różnych chorobach lub w kontekście różnych schorzeń. Procedurę barwienia zaprezentuje Maria Ali, doktorantka z mojego laboratorium.
Po uśmierceniu zwierząt ostrożnie wypreparuj kości piszczelowe i udowe z dwóch myszy, uważając, aby nie przeciąć końców kości. Następnie za pomocą ręcznika papierowego oczyść kości z wszystkich przylegających tkanek, dbając o to, by ich nie złamać. Czynności należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
Napełnić 35 milimetrową szalkę Petriego 70% etanolem, a następnie zanurzyć w etanolu kości na 10 minut. Po wysterylizowaniu kości wyjąć je z etanolu i pozostawić do wyschnięcia przez pięć minut w nowej szalce Petriego. Następnie przeciąć kość udową w połowie, a kość piszczelową w jej najcieńszej części.
Wprowadź jeden mililitr medium RPMI do wnętrza kości za pomocą sterylnej strzykawki. Zbierz zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 mililitrów i przemyj ją dwukrotnie medium RPMI, odwirowując przez 10 minut przy 300 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce z rotorem z koszykami wahadłowymi. Po ostatnim przemyciu ponownie zawieś komórki w dwóch mililitrach buforu do lizy CK i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu eliminacji erytrocytów.
Następnie należy dodać 13 mililitrów pożywki RPMI z 10% FBS i dwukrotnie wypłukać komórki w tym medium, stosując te same parametry wirowania co poprzednio. Należy policzyć komórki i dostosować ich stężenie do poziomu 2 × 10⁵ komórek na mililitr. Do pożywki RPMI z 10% FBS należy dodać rekombinowany mysi G-M-C-S-F do stężenia końcowego 20 nanogramów na mililitr.
Następnie należy dodać 10 mililitrów tej zawiesiny do sterylnej szalki Petriego o średnicy 10 centymetrów jakości mikrobiologicznej i inkubować zawiesinę komórkową w inkubatorze z dwutlenkiem węgla. Po trzech dniach do każdej z przygotowanych szalek należy dodać kolejne 10 mililitrów pożywki RPMI z 10% FBS i 20 nanogramami na mililitr rekombinowanego mysiego G-M-C-S-F.
Po kolejnych trzech dniach pobierz 10 ml zawiesiny komórkowej z każdej szalki Petriego, odwiruj komórki w tych samych warunkach, a następnie zawiesić osad w tej samej objętości medium RPMI z dodatkiem 10% FBS, która została pobrana z szalek, i uzupełnij o nowy rekombinowany mysi G-M-C-S-F. Na koniec przelej zawiesinę komórkową z powrotem do oryginalnych szalek Petriego i inkubuj komórki przez kolejne dwa dni w inkubatorze z dwutlenkiem węgla. Po ośmiu dniach hodowli pobierz komórki pływające i słabo przylegające, przemywając szalki Petriego świeżym medium.
Następnie należy oznakować zebrane komórki za pomocą zestawu do znakowania komórek Q tracker 6 55, ściśle przestrzegając instrukcji producenta, aby oznakować 5×10⁶ komórek dcs pochodzących z szpiku kostnego myszy nanokryształami Q w stężeniu 10 nM. Najpierw wymieszaj 5 µL każdego z komponentów zestawu A i B w probówce typu Eppendorf i inkubuj mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 1 mL pożywki RPMI z dodatkiem 10% FBS i mieszaj probówkę na wortexie przez 30 sekund.
Następnie do probówki typu Eppendorf dodaj 5 × 10⁵ komórek DCsuspended w 0,5 ml RPMI z dodatkiem 10% FBS i inkubuj komórki w roztworze D w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Następnie przemyj komórki dwukrotnie w RPMI z dodatkiem 10% FBS w tych samych warunkach co poprzednio i resuspenduj osad w RPMI.
Rysunek ten przedstawia przykład mikrofotografii fluorescencyjnej dcs. Bezpośrednio po znakowaniu kropla znakowanych komórek została naniesiona na szkiełko przedmiotowe i przykryta szkiełkiem cover slip. Następnie próbki oceniono przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.
Na tej rycinie widoczna jest opisana fluorescencyjna mikrofotografia dcs po 48 godzinach dojrzewania in vitro. Komórki dcs hodowano przez 48 godzin z dodatkiem 100 ng/ml LPS oraz 20 ng/ml TNF-α w komorach do hodowli na szkiełkach w inkubatorze z CO2. Następnie próbki przemyto PBS, utrwalono acetonem, zabarwiono DPI i oceniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
W dojrzałe in vitro znakowane komórki dendrytyczne (DCs) analizowano metodą cytometrii przepływowej. Komórki barwione kropkami kwantowymi (Q-dot) dawały silny sygnał w kanale FL3; analizowano komórki barwione Q-dot oraz niebarwione. DCs dodatkowo barwiono swoistymi przeciwciałami przeciwko markerom dojrzewania, CD 86 i CD 40, a także przeciwciałami kontrolnymi izotypowymi, a następnie analizowano je metodą cytometrii przepływowej. Dodatkowo w supernatantach dojrzałych DCs znakowanych Q-dot oraz w grupach kontrolnych oznaczono poziomy IL 6 i tlenku azotu.
Poniżej przedstawiono reprezentatywną figurę znakowanych DCS w wyciętym fragmencie tkanki. Dojrzałe dcs wstrzyknięto dożylnie myszom C 57 black six. Po trzech dniach myszy uśpiono i pobrano śledziony.
Próbki zamrożono gwałtownie w OCT, a następnie przygotowano przekroje o grubości ośmiu mikronów przy użyciu kriostatu. Próbki utrwalono acetonem, przeciwbarwiono DPI i oceniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, postępując zgodnie z tymi procedurami.
W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak migracja komórek dendrytycznych w odpowiedzi na różne bodźce dojrzewania, można zastosować inne metody, np. ekspozycję na antygen lub dojrzewanie z wykorzystaniem różnych stymulatorów.
Przegląd
Niniejsze badanie opisuje procedurę przygotowania komórek dendrytycznych do obrazowania z wykorzystaniem nanokryształów Qdot. Metoda ta umożliwia wizualizację komórek dendrytycznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, dostarczając informacji na temat ich właściwości migracyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Mikroskopia fluorescencyjna
Wstęp
- Komórki dendrytyczne odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej poprzez prezentowanie antygenów limfocytom T.
- Nanokryształy Qdot zapewniają stabilny sygnał fluorescencyjny do śledzenia komórek.
- Metoda ta usprawnia badanie zachowania komórek dendrytycznych w kontekście różnych jednostek chorobowych.
- Tradycyjne metody mogą nie zapewniać tak wysokiego poziomu stabilności fluorescencji.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody znakowania komórek dendrytycznych nanokryształami Qdot.
- Ułatwienie śledzenia komórek dendrytycznych in vivo.
- Zbadanie właściwości migracyjnych komórek dendrytycznych w różnych modelach chorób.
Zastosowane metody
- Izolacja komórek szpiku kostnego od myszy.
- Kultura komórek z dodatkiem GM-CSF w celu różnicowania w komórki dendrytyczne.
- Barwienie komórek dendrytycznych nanokryształami Qdot.
- Wizualizacja z użyciem mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.
Główne wyniki
- Pomyślnie znakowane komórki dendrytyczne wykazywały silne sygnały fluorescencji.
- Wykazano stabilność nanokryształów Qdot w porównaniu z tagami GFP.
- Zwizualizowano dojrzewanie i migrację komórek dendrytycznych in vitro oraz in vivo.
- Uzyskano wgląd w mechanizmy odpowiedzi immunologicznej z udziałem komórek dendrytycznych.
Wnioski
- Technika znakowania kropkami kwantowymi (Qdot) jest skuteczna w badaniu dynamiki komórek dendrytycznych.
- Metoda ta może przyczynić się do lepszego zrozumienia zachowania komórek dendrytycznych w różnych jednostkach chorobowych.
- W przyszłych badaniach można wykorzystać to podejście do analizy różnych bodźców dojrzewania.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Znakowanie komórek dendrytycznych nanokryształami Qdot umożliwia stabilną, długotrwałą fluorescencję służącą do śledzenia migracji komórek odpornościowych w modelach przedklinicznych. Podejście to wspomaga ograniczanie ryzyka mechanistycznego w rozwoju immunoterapii, zapewniając wiarygodną wizualizację dynamiki komórek prezentujących antygen. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania leków, umożliwiając bezpośrednią obserwację zachowania komórek dendrytycznych w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie szlaków migracji komórek dendrytycznych i prezentacji antygenów w modelach chorób.
- Wartość operacyjna: Zapewnia stabilną etykietę fluorescencyjną, która utrzymuje się podczas fiksacji i ekspozycji na rozpuszczalniki, co ogranicza utratę sygnału podczas przetwarzania tkanek.
- Wartość prognostyczna: Wspiera walidację funkcjonalną produktów biologicznych opartych na komórkach dendrytycznych poprzez śledzenie ich lokalizacji in vivo oraz stanu dojrzewania.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Generuje mierzalne odczyty fluorescencji do oceny stanów dojrzewania i aktywacji komórek dendrytycznych.
- Wartość operacyjna: Kompatybilny z platformami do cytometrii przepływowej i mikroskopii, co umożliwia wysokoprzepustowy screening związków immunomodulujących.
- Gotowość do analizy: Pozwala na otrzymanie zestandaryzowanych, znakowanych partii komórek dendrytycznych, odpowiednich do powtarzalnych testów profilowania immunologicznego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia śledzenie migracji komórek dendrytycznych z tkanek obwodowych do organów limfatycznych, co służy modelowaniu nadzoru immunologicznego.
- Wartość operacyjna: Pozwala na prowadzenie podłużnych badań obrazowych w modelach mysich w celu oceny odpowiedzi immunologicznych indukowanych przez szczepionki lub adiuwanty.
- Ciągłość translacyjna: Wspiera badania zorientowane na biomarkery poprzez korelację lokalizacji komórek dendrytycznych z funkcjonalnymi wynikami immunologicznymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania leków – od wczesnej walidacji celu po przedkliniczne profilowanie immunologiczne – umożliwiając wizualizację dynamiki komórek dendrytycznych jako funkcjonalnego odczytu w badaniach przesiewowych immunomodulacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących funkcji komórek dendrytycznych w wychwytywaniu antygenów, migracji i inicjowaniu odpowiedzi limfocytów T.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzowane przygotowanie znakowanych komórek dendrytycznych do przesiewania związków i profilowania immunomodulatorów.
- Analityka: Zapewnia ilościowe odczyty fluorescencyjne i cytometryczne w celu porównania dojrzewania i aktywacji komórek dendrytycznych w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy zachowanie komórek dendrytycznych in vitro z wzorcami przemieszczania się in vivo w modelach mysich istotnych dla przebiegu choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do znakowania komórek odpornościowych, możliwą do zastosowania w wielu projektach odkrywania immunoterapii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w odpowiedziach immunologicznych opśredniczonych przez komórki dendrytyczne dzięki stabilnemu, długoterminowemu śledzeniu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność między laboratoriami dzięki ustandaryzowanemu protokołowi znakowania i minimalnej zmienności partii.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go w rozwoju immunoterapii, dostarczając bezpośrednich dowodów wizualnych na zaangażowanie celu i migrację komórek odpornościowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane profile modulacji i migracji komórek dendrytycznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek pierwotnych, technikach sterylnych oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Zależne od dostępu do zestawów do znakowania Qdot, cytometrów przepływowych oraz kriotomów do sekcjonowania tkanek.
- Konieczna jest standaryzacja czasu różnicowania komórek oraz stężenia znaczników dla wszystkich użytkowników.
- Adaptacja do ludzkich modeli komórek dendrytycznych może wymagać optymalizacji warunków cytokinowych oraz wydajności znakowania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują potencjalną agregację Qdots przy wysokich stężeniach oraz konieczność dokładnego miareczkowania w celu uniknięcia cytotoksyczności.
