Identyfikacja i analiza prekursorów erytroidalnych myszy z wykorzystaniem analizy cytometrycznej CD71/TER119

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest identyfikacja prekursorów czerwonych krwinek bezpośrednio w świeżo pobranej tkance myszy. Pozwala to na badanie ich właściwości molekularnych w okresach, gdy układ erytropoetyczny u tych myszy ulega zmianom. Na przykład, podczas rozwoju embrionalnego lub w odpowiedzi na stres hipoksyczny, najpierw izoluje się tkankę krwiotwórczą z wątroby płodowej, śledziony lub szpiku kostnego myszy, a następnie dysocjuje ją do postaci zawiesiny pojedynczych komórek.

Następnie komórki znakuje się przeciwciałami przeciwko markerom powierzchni komórki CD 71 i TER 119 oraz innymi interesującymi markerami, na przykład w celu pomiaru przeżywalności komórek lub stanu cyklu komórkowego; tak przygotowaną zawiesinę znakowanych komórek analizuje się za pomocą analizatora cytometrii przepływowej, co pozwala na zidentyfikowanie specyficznych subpopulacji erytroblastów na różnych etapach dojrzewania. Te konkretne subpopulacje mogą zostać oczyszczone poprzez sortowanie komórek. Następnie dla każdej subpopulacji dojrzewających erytroblastów można przeprowadzić analizy komórkowe i molekularne.

Zdolność do identyfikacji erytroblastów na konkretnych etapach dojrzewania bezpośrednio w świeżo wyizolowanych tkankach krwiotwórczych daje nam możliwość badania komórek w fizjologicznej korze. Metoda ta pozwala zatem na badanie odpowiedzi in vivo erytroblastów na różnych etapach dojrzewania. Gdy myszy są poddawane bodźcom, następuje przyspieszenie tempa erytropoezy.

Na przykład warunki hipoksji naśladujące dużą wysokość lub wstrzyknięcie hormonu erytropoetyny. Wykorzystujemy wieloparametrową cytometrię przepływową, aby zidentyfikować erytroblasty w złożonym środowisku tkankowym i jednocześnie badać ich sygnalizację przeżycia oraz status cyklu komórkowego. Możemy również sortować erytroblasty na konkretnych etapach dojrzewania bezpośrednio z tkanki świeżej i badać poziomy ekspresji ich genów, stan chromatyny lub inne funkcje molekularne.

Definitywna erytropoeza u myszy zachodzi w śledzionie i szpiku kostnym dorosłego osobnika. W związku z tym tkanki te zostaną pobrane od uśpionej myszy. Po eutanazji myszy należy pobrać krew poprzez punkcję serca do probówek z EDTA lub heparyną; krew ta zostanie wykorzystana później do oznaczenia hematokrytu, liczby retikulocytów lub pełnej morfologii krwi (CBC).

Umieścić pobraną śledzionę i kość udową w oddzielnych probówkach zawierających zimny bufor barwiący (staining Buffer). W razie potrzeby przechowywać pobrane tkanki w lodzie. Zważyć śledzionę.

U myszy wykazujących stres erytropoetyczny prawdopodobnie wystąpi znaczny wzrost masy śledziony. Następnie, z pobranych tkanek przygotowuje się komórki śledziony i komórki szpiku kostnego zgodnie z procedurami zaprezentowanymi wcześniej dla zarodka myszy. Erytropoeza definitywna zachodzi w wątrobie płodowej między 12,5 a 15,5 dniem embryonicznym.

Ciążne myszy samice z określonym czasem poczęcia są przygotowywane do pozyskania komórek wątroby płodowej w dniach od 12,5 do 14,5 ciąży. Ciążne myszy samice są uśmiercane, a rogi macicy przenoszone do szalki Petriego z lodem. Stosuje się zimną pożywkę hodowlaną lub bufor barwiący.

Do sekcji wątroby płodowej z dnia embrionalnego 12.5 lub wcześniejszego w celu wyjęcia embrionów z macicy wymagany jest stereomikroskop. Najpierw należy oddzielić każdy zarodek od rogu macicy. Następnie ostrożnie wycina się ścianę macicy, aby uwolnić embrion znajdujący się w pęcherzyku owodniowym.

Ostrożnie odwarstw błonę owodniową. Wątroba płodu to największa czerwona tkanka brzuszna, znajdująca się poniżej znacznie mniejszego serca. Aby wypreparować wątrobę płodu, należy użyć pęsety, aby unieruchomić embrion po obu stronach wątroby, a następnie delikatnie wypchnąć wątrobę z jamy brzusznej do medium.

Ostrożnie przeniesiono wątrobę do probówki zawierającej świeży bufor barwiący. Po wycięciu wszystkich wątrób płodowych i przeniesieniu ich do probówki ze świeżym buforem barwiącym, wątroby zdysocjowano mechanicznie poprzez pipetowanie, a następnie przefiltrowano zdysocjowane komórki przez nylonowe sito o oczkach 40 µm. Komórki przemyto dwukrotnie poprzez wirowanie, odrzucając nadsącz i resuspendując materiał w buforze barwiącym.

Po drugim przemyciu barwi się komórki trypanem niebieskim i zlicza je za pomocą hemocytometru. Wątroba płodowa w stadium E 13.5 zawiera około 10⁷ komórek. Następnie resuspendsuje się komórki w stężeniu od 1 do 2 × 10⁶ komórek na 200 µl próbki w celu przeprowadzenia analizy cytometrycznej.

Na potrzeby niniejszego protokołu wideo barwienie przeciwciałami do cytometrii przepływowej zostanie zaprezentowane wyłącznie na komórkach wątroby płodowej. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować mieszaninę wstępną do barwienia przeciwciałami pierwszorzędowymi zawierającą następujące składniki: oczyszczone króliki IgG do blokowania receptorów FC w komórkach mysich, CD 71 FETR one 19 PE oraz przeciwciało skierowane przeciwko białku powierzchniowemu komórki fast. Należy delikatnie wymieszać roztwór przeciwciał, odwracając probówkę dwa do trzech razy, a następnie dodać 200 µL mieszaniny wstępnej do wcześniej przygotowanej próbki komórek wątroby płodowej i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby resuspenderować komórki.

Następnie należy przygotować sześć kontrolnych próbek komórek. Próbkę niebarwioną, w której komórki pozostają w buforze do barwienia w celu określenia tła autofluorescencji komórek, oraz próbki jednobarwne dla każdego przeciwciała lub barwnika użytego w protokole w celu skorygowania nakładania się widm między kanałami, którymi w tym eksperymencie są TUR one 19 PE CD 71 fz fast, biotyna i streptawidyna A PC oraz kontrolę fluorescence minus one (FMO) dla fast biotin, która zapewnia rzeczywiste tło dla tego kanału, gdzie komórki są barwione wszystkimi kolorami lub przeciwciałami przewidzianymi w protokole z wyjątkiem fast biotin. Próbkę oraz odpowiednie kontrole należy inkubować w barwniku z przeciwciałami pierwszorzędowymi na lodzie przez 45 minut do jednej godziny w ciemności.

Po zakończeniu inkubacji należy wyprać komórki, dodając trzy mililitry buforu barwiącego do każdej probówki z próbką, a następnie wirować przez trzy do pięciu minut z prędkością około 400 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie należy dodać strep avid in a PC i inkubować probówki w lodzie przez 30 do 45 minut. Po zakończeniu inkubacji komórki należy wyprać w ten sam sposób, co podczas barwienia pierwszym przeciwciałem.

Na koniec resuspendować komórki w roztworze barwiącym zawierającym nieprzenikający do wnętrza komórek barwnik DNA seven a a d w celu wykluczenia martwych komórek. Próbki są teraz gotowe do analizy cytometrycznej. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest prawidłowa analiza bramkowania zdarzeń cytometrycznych, umożliwiająca wiarygodną identyfikację subpopulacji erytroblastów.

Wymaga to starannego przygotowania urządzenia, wszystkich odpowiednich próbek kontrolnych, precyzyjnej kompensacji nakładania się widm oraz późniejszego bramkowania w celu wykluczenia martwych komórek, agregatów i zdarzeń o bardzo małych rozmiarach. Na początku analizy danych próbka niebarwiona oraz próbki kontrolne jednobarwne są wykorzystywane do ustawienia kompensacji nakładania się widm dla każdej kombinacji kolorów.

W tym przykładzie pokażemy, w jaki sposób fluorescencja FITC przenika do kanału PE oraz jak to nakładanie się widm jest korygowane po kompensacji. Najpierw, korzystając z niebarwionej kontroli, definiujemy obszar FITC-dodatni i PE-ujemny. Następnie, używając kontroli jednobarwnej FITC, możemy zwizualizować przenikanie widmowe do kanału PE.

Po przeprowadzeniu kompensacji cyfrowej w oprogramowaniu FlowJo, sygnał spillover fit E w kanale PE zostaje zminimalizowany. Po kompensacji można usunąć martwe komórki, agregaty oraz zdarzenia o małej wielkości. Agregaty i dublety komórkowe są usuwane poprzez wykreślenie wysokości rozproszenia światła w przód (FSC-H) względem powierzchni rozproszenia światła w przód (FSC-A) i wybranie zdarzeń znajdujących się wewnątrz wąskiej bramki diagonalnej.

Martwe komórki są usuwane poprzez selekcję komórek wykazujących brak sygnału dla barwnika DAPI, który jest nieprzenikalny dla błony komórkowej i wiąże się z DNA. Brama dla żywych komórek DAPI-ujemnych wyklucza również bardzo małe zdarzenia, takie jak jądra komórkowe lub detrytus, które charakteryzują się bardzo niskim rozproszeniem światła w przód (forward scatter). Następnie przedstawimy strategię bramkowania dla komórek wątroby płodowej.

Świeżo zebrane komórki znakowano przeciwciałem CD 71 TUR one 19 oraz koktajlem przeciwciał znakowanych ZI skierowanych przeciwko markerom linii nieerytroidalnej. W tym przykładzie próbki zostały już poddane kompensacji w celu usunięcia nakładania się widm, a następnie wyselekcjonowano bramkę, aby wykluczyć agregaty, martwe komórki oraz zdarzenia o bardzo małej wielkości. Wykorzystujemy próbkę FMO, która zawiera wszystkie barwniki z wyjątkiem barwienia fitzy dodatniego dla danej linii, aby wykreślić histogram fitzy i zdefiniować bramkę dla komórek ujemnych pod względem linii; następnie stosujemy tę bramkę do próbki komórek wątroby płodowej, która została zabarwiona markerami linii sprzężonymi z ZI.

Komórki lineage-ujemne są selekcjonowane i naniesione na wykres z CD 71 na osi Y oraz TER 19 na osi X. Na osi X komórki są teraz gotowe do podziału na podgrupy od S0 do S5. Podgrupa S0 z ubytkiem Lin zawiera głównie komórki o potencjale CFUE przed wystąpieniem zależności od EPO.

Podzbiór S1 zawiera komórki CFUE zależne od EPO, znajdujące się głównie w fazie S cyklu komórkowego. Komórki podzbioru S2 utraciły zdolność do tworzenia kolonii i zaczynają wykazywać ekspresję hemoglobiny. Komórki podzbioru S3 to w większości erytroblasty bazofilne, natomiast podzbiory S4 i S5 zawierają erytroblasty późne. Przedstawiono tutaj strategię analizy po pozyskaniu danych z komórek śledziony, które zostały przetworzone i znakowane przeciwciałami skierowanymi przeciwko CD 71 i TER 119, a także histogram receptora śmierci Fas.

Na jednym z nich pokazano wszystkie zarejestrowane zdarzenia, gdzie bramka diagonalna reprezentuje zdarzenia będące prawdopodobnie pojedynczymi komórkami, z wyłączeniem dubletów lub większych agregatów. Komórki znajdujące się w tej bramce są następnie analizowane na drugim histogramie. Bardzo małe zdarzenia, będące prawdopodobnie jądrami komórkowymi lub debrisem, zostają wykluczone.

Wyselekcjonowane komórki przedstawiono na histogramie trzecim, gdzie wykluczono z dalszej analizy komórki DAPI-dodatnie, które prawdopodobnie są przepuszczalne przez błonę komórki apoptotycznej. Histogram czwarty przedstawia wynikową populację żywotnych komórek śledziony. Brama pro eGate zawiera komórki CD 71 high TER one 19 Intermediate; komórki tur R one 19 high są dalej analizowane na histogramie piątym.

Tutaj komórki o wysokiej ekspresji CD 71 są podzielone na mniej dojrzałe, duże komórki z obszaru A (erytroblasty) oraz mniejsze, bardziej dojrzałe erytroblasty z obszarów B. Najbardziej dojrzałym podzbiorem erytroblastów jest ARI C. Ekspresję białek powierzchniowych komórek dla każdego z tych podzbiorów można zmierzyć jednocześnie, dodając odpowiednie przeciwciała w tym samym czasie co TER R 19 i CD 71. Histogram barwienia 6 przedstawia ekspresję powierzchniową receptora śmierci Fas, konkretnie w podzbiorze A u myszy w stanie podstawowym oraz u myszy po wstrzyknięciu pojedynczej dawki Epo.

Wyniki wskazują, że EPO hamuje szybką ekspresję w tym obszarze. Dla komórek w każdym podzbiorze można również zmierzyć populacyjną ekspresję białek wewnątrzkomórkowych in vivo lub status cyklu komórkowego. W tej reprezentatywnej analizie cyklu komórkowego myszom wykonano wtrysk BRDU dootrzewnowo, a szpik kostny pobrano od 30 do 60 minut później.

Oprócz barwienia na CD 71 i TER one 19, komórki poddano barwieniu na wbudowanie BRDU do replikującego się D-N-A-B-R-D-U; komórki dodatnie pod kątem BRDU znajdują się w fazie S cyklu. Komórki w interfazie są ujemne pod kątem BRDU i mogą zostać rozdzielone na fazy G one lub G two M. Przy użyciu DNAD seven A A D komórki mogą być sortowane z każdej z podgrup PRO E area A A B oraz A EC.

Tutaj są one przedstawione w preparatach cytologicznych wykazujących sekwencyjne dojrzewanie, objawiające się zmniejszeniem rozmiaru komórek, kondensacją jądra oraz nasileniem brązowego zabarwienia odzwierciedlającego ekspresję hemoglobiny. Na koniec przedstawiono reprezentacyjną analizę cyklu komórkowego podzbioru S3 w wątrobie płodowej myszy w dniu E 13.5. Ciężarnym myszom wstrzyknięto BRDU.

Wątroby płodowe pobrano, a po 30 do 60 minutach utrwalono, przepuszczalno i barwiono przeciwciałami przeciwko CD 71, TER one 19 oraz BRDU. Analizie poddano status cyklu komórkowego komórek S3, w której komórki w fazie S są dodatnie pod kątem BRDU, a zawartość DNA określono poprzez barwienie barwnikiem DNA seven A a d.

Opisane przez nas podejście cytometryczne pozwala na jednoczesne badanie funkcji komórkowych, takich jak ekspresja markerów powierzchniowych i innych białek, przeżywalność komórek, sygnalizacja komórkowa z wykorzystaniem przeciwciał fosfospecyficznych oraz status cyklu komórkowego. Pozwala nam to zatem badać odpowiedzi molekularne erytroblastów, będących odmiennym stadium dojrzewania, na szeroki zakres bodźców lub efekt mutacji genetycznych. Należy zauważyć, że podgrupy dojrzewania w cytometrii przepływowej są definiowane w oparciu o ekspresję markerów powierzchniowych oraz rozpraszanie przednie.

Stwierdziliśmy, że ogólnie komórki w każdym podzbiorze odpowiadają podobnemu stadium morfologicznemu erytroblastów w szerokiej gamie modeli mysich. Zalecamy jednak zweryfikowanie tego podczas badania nowego modelu mysiego. Poprzez sortowanie komórek z każdego podzbioru i analizę ich morfologii. Komórki z każdego podzbioru można również sortować do analizy RNA lub transkryptomu; w eksperymentach sortowania należy stosować niskie ciśnienia sortowania oraz szerokie dysze, aby zminimalizować naprężenia ścinające działające na komórki.

Zalecamy również sprawdzanie czystości i żywotności komórek po każdym eksperymencie sortowania. Wreszcie, podczas wykrywania zmiany w częstotliwości występowania danej subpopulacji, ważne jest określenie, czy wynika ona z rzeczywistej zmiany liczby komórek w tej subpopulacji, czy z przesunięć w innych subpopulacjach. Dlatego, oprócz pomiaru częstotliwości subpopulacji, zawsze konieczne jest również zmierzenie bezwzględnej liczby komórek w każdej z nich.