Nanocząstki fluorescencyjne do pomiaru stężenia jonów w systemach biologicznych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wytworzenie nanoczujników sodu do zastosowań in vitro i in vivo. Osiąga się to poprzez przygotowanie mieszaniny optycznej zawierającej komponenty czujników dla nanoczujników. W drugim kroku surfaktant poddawany jest sonikacji w roztworze wodnym w celu jego równomiernego rozprowadzenia, co umożliwi formowanie nanoczujników po dodaniu mieszaniny optycznej.

Następnie, w warunkach sonikacji, do wodnej mieszaniny surfaktantów dodaje się mieszaninę optyczną w celu utworzenia nanoczujników w roztworze. Niniejszy film demonstruje, że odpowiedź czujnika jest regulowana. Czujniki mogą być wstrzykiwane mikroiniekcyjnie do kardiomiocytów, a także wstrzykiwane podskórnie u myszy.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak fluorescencyjne barwniki wskaźnikowe, jest możliwość dostrojenia czujników do zakresu dynamicznego odpowiadającego środowisku fizjologicznemu, pomiaru szerszego zakresu analitów oraz przeprowadzania pomiarów ratiometrycznych w celu analizy ilościowej. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotykać trudności, ponieważ po wytworzeniu czujników ich wprowadzenie do środowiska biologicznego może wydawać się onieśmielające. Przed przygotowaniem optod zgodnie z protokołem należy wcześniej przygotować roztwory zapasowe suchego jonu sodu four x, suchego sodu TFPB oraz chromo four three.

W dygestorium należy połączyć wszystkie materiały w szklanej fiolce o pojemności 1,5 ml. Zamykając fiolkę nakrętką z powłoką teflonową, należy ją delikatnie wymieszać w wstrząsarce wirowej (vortex), aż cały PVC zostanie rozpuszczony. Roztwór powinien mieć czerwony kolor.

Rozpocznij przygotowywanie nanoczujników, dodając 100 µL roztworu lipidów PEG o stężeniu 10 mg/mL do szklanej fiolki o pojemności 4 g. Następnie dodaj 4 mL odpowiedniego roztworu wodnego, na przykład 10 mM HEPES.

Zanurz końcówkę sonikatora na siedem milimetrów w fiolce, korzystając z podnośnika laboratoryjnego, i zastosuj niską moc sonikacji przez 30 sekund. W probówce o pojemności 0,6 ml połącz 50 µl materiału optycznego i 50 µl dichlorometanu, używając pipety, aby zapewnić równomierne wymieszanie. Następnie rozpocznij trzy minutową sonikację.

Po rozpoczęciu sonikacji należy dodać 100 µL mieszaniny opto, zanurzając końcówkę pipety i dozując całą objętość jednym szybkim, równomiernym wtryskiem. Roztwór zmieni kolor na niebieski, jeśli pH wzrośnie powyżej siedmiem i jeśli w roztworze nie ma sodu, który usunąłby pozostałości THF i dichlorometanu. Przesuń końcówkę sonikacyjną na głębokość 2 mm.

W ciągu pozostałych trzech minut roztwór stanie się mętny. Po zakończeniu sonikacji naciągnij roztwór nanoczujnika do strzykawki o pojemności 5 ml. Podłącz filtr i przelej roztwór nanoczujnika do szklanej fiolki z nakrętką.

Należy rozpocząć od przygotowania 10 roztworów o progresywnie zwiększającym się stężeniu sodu, względem których będzie można zmierzyć czułość nanoczujnika. Połączyć roztwory zasobowe sodu o stężeniu zero moli i jednego mola w stożkowych probówkach o pojemności 50 mililitrów. Następnie w płycie 96-dołkowej z dnem optycznym dodać 100 mikrolitrów każdego stężenia sodu do trzech dołków w jednej kolumnie.

Następnie należy dodać 100 µL świeżo przygotowanych nanoczujników do każdej studni, umieścić płytkę w fluorymetrze do mikropłytek i wprowadzić długości fal wzbudzenia, emisji oraz odcięcia, które są optymalne dla stosowanego chromoforu. Wybór mierzonych długości fal zależy od zastosowania. Długości fal te umożliwiają pomiary szybkiej dynamiki wewnątrzkomórkowej lub redukcję szumów.

Aby uzyskać wartości alfa, należy podzielić natężenie przy 570 nanometrach przez natężenie przy 670 nanometrach lub 680 nanometrach. Następnie należy nanieść wartości alfa na wykres w funkcji logarytmu stężenia sodu, przyjmując wartość minus jeden dla logarytmu zerowego stężenia sodu.

Następnie dopasuj krzywą sigmoidalną do odpowiedzi i na podstawie tej krzywej oblicz stężenie sodu, przy którym wartość alfa wynosi 0,5. Reprezentuje ono stężenie sodu, przy którym czujnik reaguje optymalnie. Wykorzystując tę informację, dostosuj stosunek sodium iono four x sodium TFPB oraz chromo iono four three w opto, aby stworzyć nanoczujniki o optymalnym stężeniu sodu.

Na przykład, krzywe odpowiedzi hero pięciu różnych zestawów nanoczujników reprezentujących różne formulacje optyczne, różniących się jedynie ilością sodu z czterech 10. Do obrazowania wewnątrzkomórkowego należy zastąpić pożywkę komórkową przejrzystą pożywką, taką jak roztwór Tyro, a następnie przenieść komórki do komory obrazowania. Teraz należy napełnić wyciągniętą pipetę szklaną roztworem nanoczujników przygotowanym w 5 mg/mL glukozy w wodzie.

Następnie zamocuj pipetę do mikromanipulatora i podłącz ją do systemu wtryskiwania sterowanego ciśnieniem. Obniż pipetę nad komórką i wprowadź ją do cytoplazmy. Czasami konieczne jest stuknięcie w uchwyt manipulatora, aby przebić błonę.

Wstrzyknij kilkaset pikolitrów roztworu nanoczujnika i szybko wycofaj pipetę. Znieczul mysz naga CD-1 przy użyciu izofluoranu w komorze do znieczulania. Po znieczuleniu umieść mysz w zdezynfekowanej komorze obrazującej.

Następnie należy napełnić sterylną strzykawkę insulinową o rozmiarze 31G 10 µL nanoczujników o odpowiedniej wartości KD w 10 mM PBS. Należy upewnić się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte za pomocą pęsety. Chwyćcie niewielki fałd skóry na grzbiecie myszy w wybranym miejscu wstrzyknięcia, trzymając skórę.

Wprowadź strzykawkę w skórę ściętym końcem igły skierowanym do góry i igłą równolegle do powierzchni skóry. Następnie odciągnij tłok strzykawki, aby upewnić się, że igła nie została wprowadzona do naczynia krwionośnego. Aby zminimalizować ciśnienie wsteczne, delikatnie przesuń igłę w prawo i w lewo, tworząc w skórze niewielką przestrzeń.

Następnie wstrzyknij sensory i ostrożnie wyjmij strzykawkę. Delikatnie uciśnij miejsce wstrzyknięcia i przemyj wszelki roztwór, który mógł wycieknąć z miejsca iniekcji. Zazwyczaj wykonuje się sześć równomiernie rozmieszczonych wstrzyknięć wzdłuż grzbietu.

W przypadku wykonywania procedury na różnych myszach, należy wymienić igłę, aby zminimalizować ryzyko przeniesienia choroby oraz kontaminacji krzyżowej. Po iniekcjach należy wykonać obrazy w świetle przechodzącym oraz fluorescencyjne, korzystając z zestawów filtrów ściśle dopasowanych do widma wzbudzenia i emisji nanoczujników. Pozwala to również zminimalizować autofluorescencję skóry.

Te neonatalne kardiomiocyty hodowano na szkiełku podstawowym i wstrzyknięto w nie nanoczujniki sodu. Ten obraz fluorescencyjny został wykonany przy długości fali wzbudzenia 639 nanometrów. Jest to obraz w świetle przechodzącym tych samych komórek, a tutaj znajduje się nałożenie obu obrazów.

Występuje pewna agregacja sensorów, jednak komórki zachowują prawidłową morfologię. Sensory rozprzestrzeniły się w całym cytosolu i nie obserwuje się ich gromadzenia w jądrach komórkowych. Ta nałożona na siebie obraz z jasnego pola oraz obraz fluorescencyjny przedstawia dziewięć różnych podskórnych wstrzyknięć nanosensorów sodu do przestrzeni podskórnej gołego myszy.

Wytwarzanie nanoczujników Masten może zająć zaledwie kilka minut, jeśli zostanie przeprowadzone prawidłowo, i może zostać zastosowane w dowolnych badaniach do pomiaru odwracalnego przepływu anality w czasie rzeczywistym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat wprowadzania nanoczujników do przestrzeni wewnątrzkomórkowej lub podskórnej w celu wykonania pomiarów ilościowych w środowisku biologicznym.