Trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry: narzędzie do badania normalnej skóry i progresji czerniaka

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie trójwymiarowej rekonstrukcji ludzkiej skóry do badań nad biologią melanocytów, czerniaka oraz macierzystych komórek skóry. Osiąga się to najpierw poprzez pokrycie wkładki tacek do hodowli tkankowej zneutralizowanym kolagenem bydlęcym. Drugim krokiem jest utworzenie komórki dermalnej z fibroblastów i kolagenu.

Następnie przygotowuje się przedział naskórkowy z keratynocytów zmieszanych z melanocytami lub komórkami czerniaka. Ostatnim etapem procedury jest pobranie zrekonstruowanej skóry w 18. dniu oraz przeszczepienie jej myszy. Ostatecznie analizy immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne przeszczepu wykazują architekturę prawidłowej skóry zawierającej melanocyty, migrację i różnicowanie prawidłowych komórek macierzystych oraz fenotypy czerniaka specyficzne dla danego stadium.

Model rekonstrukcji skóry opracowaliśmy 20 lat temu, ponieważ na wczesnym etapie naszych badań odkryliśmy, że prawidłowe melanocyty lub komórki czerniaka hodowane na szalce zachowują się zupełnie inaczej niż komórki w kontekście tkankowym. Model rekonstrukcji skóry jest zatem dla nas idealnym narzędziem do obserwacji sposobu, w jaki komórki przemieszczają się z jednego przedziału skóry do dowolnego innego miejsca. Wcześniej przygotowaną bezkomórkową warstwę mieszaniny kolagenowej schłodzono na lodzie, a następnie do każdego insertu sześciodołkowej płytki dodano 1 mL słomkowożółtego roztworu.

Tackę do hodowli tkankowej w dołkach inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby żel mógł stężeć. W tym czasie, podczas tężenia żelu, kolor roztworu powinien zmienić się z żółtego na różowy. Trypsynizować ludzkie fibroblasty w kolbie hodowlanej za pomocą 0,25% trypsyny z EDTA przez pięć minut. Dodać DMEM zawierający 10% FBS, aby zneutralizować proces trypsynizacji.

Oddzielone komórki zebrać poprzez wirowanie przez pięć minut przy 200 G w temperaturze pokojowej, a następnie resuspender komórki do stężenia 4,5 × 10⁵ komórek w 1,5 ml DMEM uzupełnionego o 10% FBS. Następnie napełnić probówkę o pojemności 50 ml wcześniej przygotowaną mieszaniną kolagenu warstwy komórkowej i umieścić probówkę w lodzie.

Do probówki dodać 1,5 ml zawiesiny fibroblastów i dokładnie wymieszać. Do każdego insertu pokrytego warstwą acellularną dodać trzy ml słomkowożółtego roztworu warstwy komórkowej. Następnie inkubować taczkę do hodowli tkankowej przez 45 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowej z 5% carbon dioxide.

Kolor roztworu warstwy komórkowej powinien również zmienić się z żółtego na różowy. Po zastygnięciu żelu w warstwie górnej, należy dodać dwa mililitry DMEM zawierającego 10% FBS do wnętrza wkładki w płytce do hodowli tkankowej oraz 10 mililitrów na zewnątrz wkładki. Płytki do hodowli tkankowej należy inkubować przez cztery dni.

W czwartym dniu inkubacji, po sprawdzeniu, czy żel uległ skurczeniu, odessać pożywkę z wnętrza i z zewnątrz każdego wkładu. Dodać 2 mL pożywki do płukania do wnętrza oraz 10 mL na zewnątrz wkładów, aby wypłukać surowicę. Następnie inkubować tacki przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C w celu regeneracji naskórka.

Najpierw poddaj ludzkie keratynocyty trypsynizacji. Następnie, po pięciu minutach, użyj inhibitora trypsyny z soi w celu neutralizacji trypsyny po odwirowaniu ododerwanych komórek z prędkością 200 G przez pięć minut. Ponownie zawiesź osad komórkowy w skórze w stężeniu 4,17 × 10⁶ komórek/ml.

Odtwórz pożywkę po zebraniu keratynocytów. Inkubuj ludzkie melanocyty z trypsyną w temperaturze 4°C przez jedną do dwóch minut. Następnie zneutralizuj trypsynę za pomocą inhibitora trypsyny z soi.

Następnie, po odwirowaniu komórek w tych samych warunkach co wcześniej, resuspender osad melanocytów do stężenia 8,3 × 10⁵ komórek/ml w medium skin. Należy również przygotować medium one. W dalszej kolejności usunąć medium piorące z wnętrza i z zewnątrz każdego insertu w tacy do hodowli tkankowej z przygotowaną warstwą dermalną.

Wymień medium płuczące, dodając 1,5 mililitra medium do rekonstrukcji skóry do wnętrza oraz 10 mililitrów na zewnątrz każdego insertu. Następnie wymieszaj 600 mikrolitrów zawiesiny keratynocytów z 600 mikrolitrami zawiesiny melanocytów. Odmień 200 mikrolitrów zmieszanej zawiesiny komórek.

Kropla po kropli do wnętrza każdego wkładu. Inkubować tackę do hodowli tkankowej przez dwa dni w temperaturze 37 °C. Po inkubacji komórek aspirować podłoże do rekonstrukcji skóry 1 zarówno z wnętrza, jak i z zewnątrz każdego wkładu, a następnie dodać 2 mL podłoża do rekonstrukcji skóry 2 do wnętrza oraz 10 mL do zewnętrznej części wkładu.

Następnie inkubować rekonstrukcje przez kolejne dwa dni w temperaturze 37 °C. Po drugiej dwudniowej inkubacji odessać pożywkę do rekonstrukcji skóry 2 z wnętrza i z zewnętrznej strony każdego insertu. Następnie dodać 7,5 ml pożywki do rekonstrukcji skóry 3 wyłącznie na zewnętrzną stronę insertów.

Umieścić rekonstrukty z powrotem w inkubatorze i wymienić pożywkę. Wymieniać pożywkę do rekonstrukcji co drugi dzień aż do 18. dnia. W 18. dniu inkubacji odessać pożywkę z wnętrza i z zewnętrznej strony wkładów w tacy do hodowli tkankowej z załadowanymi rekonstruktami skóry.

Za pomocą pęsety wyjmij wkłady z tacki. Wytnij konstrukt wraz z filtrem poliwęglanowym, prowadząc ostrzem skalpela wzdłuż krawędzi po okręgu. Następnie umieść konstrukt na filtrze na twardej powierzchni i przekrój go na pół ostrzem skalpela.

Umieść połowę rekonstruktu na czarnym papierze do biopsji TBS, a następnie włóż papier do kasety histologicznej. Namocz całą kasetę w 10% formalinie przez ponad cztery godziny. Następnie umieść kasetę w 70% etanolu i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsius until będziesz gotowy do przetworzenia rekonstruktu w celu zatopienia w parafinie.

Umieścić drugą połowę rekonstruktu w 50% sacharozie w temperaturze 4 °C przez jedną do dwóch godzin. Następnie zmienić stężenie sacharozy na 2 M i przechowywać w temperaturze 4 °C przez kolejne jedną do dwóch godzin. Wypełnić formę do tkanek do połowy medium OCT (optimal cutting temperature freezing media).

Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Chwycić krawędź rekonstruktu pęsetą i wyjąć go z sacharozy. Położyć go na chusteczkach Kim wipes do czasu wchłonięcia sacharozy.

Za pomocą pęsety i szpatułki przenieś rekonstrukt do łódzki na wierzch OCT. Przykryj górę rekonstruktu kolejną porcją OCT, aż łódzka zostanie całkowicie wypełniona. Ponownie unikaj powstawania pęcherzyków powietrza.

Umieść formę równomiernie na kruszonym suchym lodzie, aby OCT mógł całkowicie zamarznąć. Następnie owiń formę podstawową i folię, a następnie przechowuj w temperaturze -70 °C aż do momentu krioostatycznego cięcia. Aby przygotować się do przeszczepienia zrekonstruowanej skóry na mysz, napełnij pojemnik ciekłym azotem i dodaj 5 mL DMEM do probówki o pojemności 50 mL.

Napełnij zlewkę 600 mililitrami wody z kranu i postaw ją na płycie grzewczej w celu ogrzania. Następnie wybierz samicę myszy outbred rasy skid hairless w wieku około sześciu tygodni. Po znieczuleniu myszy izofluranem.

W celu utrzymania znieczulenia przez cały czas trwania procedury należy zastosować maskę nosową. Należy nałożyć sterylny lubrykant do oczu oraz zapewnić ogrzewanie, aby zapobiec hipotermii. Następnie skórę myszy należy oczyścić za pomocą tinduktury benzoesanowej i gazików nasączonych alkoholem.

Zaznaczyć linię na grzbiecie myszy, aby zachować tę samą pozycję do późniejszego szycia. Za pomocą nożyczek irydowych i pęsety wyciąć okrągłe łoże rany na grzbiecie myszy, a następnie przykryć łoże rany sterylnymi gązkami gazowymi. Okrągły fragment skóry myszy umieścić w 50 mililitrowej probówce z DMEM.

Zanurz probówkę w pojemniku z ciekłym azotem, aż wszystkie pożywki i tkanka całkowicie zamarzną. Następnie rozmroź probówkę w zlewce z gorącą wodą do całkowitego odtajania. Powtórz tę procedurę zamrażania i rozmrażania trzy razy.

Używając skalpela, oddziel rekonstrukt skóry od wkładki. Bardzo ostrożnie usuń membranę, a następnie przenieś rekonstrukt skóry na wierzch łoża rany myszy. Następnie ułóż skórę myszy na wierzchu rekonstruktu skóry.

Należy upewnić się, że pierwszy szew znajduje się nad wcześniej oznaczonym markerem, a drugi pod nim. Następnie należy użyć dwóch kolejnych szwów po bokach zrekonstruowanej skóry, aby unieruchomić skórę myszy. Po przeszczepieniu skórę myszy należy oczyścić, a następnie umieścić mysz w nowej klatce.

W 18. dniu naskórek rekonstruktu skóry składa się z warstw keratynocytów ułożonych warstwowo; niediferencjowana warstwa podstawna oraz kolejno różnicujące się warstwy są zorientowane pionowo. Wykonano barwienie przekroju rekonstruktów z użyciem markera melanocytowego.

S 100, wskazane czarnymi strzałkami, pokazuje, że melanocyty są ułożone w warstwie podstawnej naskórka i komunikują się z wieloma keratynocytami poprzez wypustki dendrytyczne. Przedział skórny zawiera fibroblasty osadzone w macierzy kolagenu typu jeden; osadzony kolagen cztery wskazuje błonę podstawną, która oddziela naskórek od skóry właściwej. Następne ryciny ilustrują sposób powstawania wielu warstw keratynocytów w naskórku.

Kiedy dermalne komórki macierzyste znakowane lentiwirusem GFP są osadzone wraz z fibroblastami w matrycy z kolagenu typu I, migrują one do naskórka i w piątym dniu różnicują się w melanocyty. Po wysianiu keratynocytów pojedyncze komórki zaczynają migrować na zewnątrz sfer.

Należy zauważyć, że naskórek nadal składa się z jednej warstwy. W ósmym dniu kilka komórek dociera do granicy między naskórkiem a skórą właściwą.

Do 10. dnia komórki GFP-dodatnie są ściśle ułożone w pozycji błony podstawnej, co widać tutaj. Zmigrowane komórki GFP-dodatnie w naskórku wykazują ekspresję markera melanocytarnego HMB 45. W przypadku włączenia linii komórkowych czerniaka na różnych etapach rozwoju do rekonstruktów skóry, zachowanie komórek odzwierciedla ich charakterystykę in vivo.

Na tej rycinie przedstawiono prawidłowe melanocyty oraz komórki czerniaka hodowane w kulturach 2D. Lokalizacja i tempo wzrostu prawidłowych melanocytów są ściśle kontrolowane w rekonstrukcjach skóry, jak pokazano tutaj; w fazie wzrostu radialnego pierwotne czerniaki proliferują głównie w naskórku, podczas gdy czerniaki w fazie wzrostu pionowego wrastają inwazyjnie w skórę właściwą, co widać na tej rycinie. Na koniec, tutaj zaprezentowano sposób, w jaki czerniaki przerzutowe agresywnie naciekają głębokie warstwy skóry właściwej.

Nasze badania nad prawidłową skórą stanowią podstawę do lepszego zrozumienia rozwoju i progresji czerniaka.