Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zmiana ekspresji genów w neuronach embrionalnego ośrodkowego układu nerwowego. Osiąga się to poprzez uprzednie pozyskanie samic w określonym czasie ciąży i przygotowanie ich do zabiegu chirurgicznego. Następnie, poprzez wykonanie nacięcia w obrębie jamy brzusznej, odsłania się rogi macicy.

Po odsłonięciu embrionów DNA wstrzykuje się do komory bocznej, trzeciej komory lub przestrzeni podsiatkówkowej. Ostatnim krokiem procedury jest przyłożenie prądu elektrycznego do embrionu przez ścianę macicy, przy czym elektrody płaskie orientuje się tak, aby biegun dodatni znajdował się nad preferowanym miejscem transfekcji. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące proliferację, migrację i różnicowanie progenitorów neuronalnych w tline kelon dying kelon i siatkówce za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie myszy transgenicznych, jest jej szybkość, możliwość prowadzenia badań o wyższej przepustowości oraz niższy koszt. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu rozwoju układu nerwowego, takie jak to, które geny regulują komórki progenitorowe neuronów, proliferację komórek, specyfikację losu komórek, różnicowanie neuronalne oraz migrację komórek. Zastosowanie tej techniki może prowadzić do lepszego zrozumienia szlaków genetycznych leżących u podstaw wad rozwoju OUN, z których wiele skutkuje upośledzeniem poznawczym i zaburzeniami behawioralnymi u ludzi, wykraczając poza jej użyteczność w badaniu rozwoju ośrodkowego układu nerwowego.

Tę technikę można zastosować również do innych układów narządowych, takich jak rozwijający się obwodowy układ nerwowy, serce oraz łożysko. Można ją także wykorzystać do badania modeli chorób u myszy, a także u innych organizmów modelowych, takich jak kurczaki i xip. Zazwyczaj główną przeszkodą w osiągnięciu sukcesu przez osoby rozpoczynające pracę z tą techniką jest przeżywalność zarodków; należy zachować szczególną ostrożność podczas manipulowania, wstrzykiwania i przenoszenia zarodków.

Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy potrzebowaliśmy szybkiego sposobu na manipulację ekspresją genów w zarodku, telencefalonie i siatkówce. Opracowaliśmy tę technikę w naszym laboratorium, modyfikując metodę pierwotnie opisaną przez Sal i opublikowaną w czasopiśmie Developmental Biology w 2001 roku. Współpracowaliśmy również z zewnętrznym laboratorium, aby ustanowić ten protokół także w rozwijającym się dilonie.

Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy wstrzykiwania i elektroporacji są trudne do opanowania, gdyż wymagają bardzo precyzyjnej manipulacji embrionami, a miejsca wstrzyknięcia mogą być niekiedy bardzo małe, na przykład przestrzeń podsiatkówkowa. Procedurę zaprezentuje dziś Rajiv, postdoc z laboratorium Shermana. Na początek należy oczyścić i wysterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne. Następnie należy napełnić strzykawki roztworem soli fizjologicznej oraz roztworem Ringer'a z mleczanami i umieścić je na podkładce grzewczej w strefie operacyjnej w celu ogrzania.

Sterylizujemy podkładkę grzewczą 70% etanolem, a następnie przykrywamy ją sterylnym gazikiem. Ustawiamy podkładkę grzewczą na 37°C. Zwierzę umieszczamy w małej komorze anestezyjnej i znieczulamy, podając 5% izofluranu z tlenem z przepływem 1 l/min poprzez waporyzator.

Należy upewnić się, że spaliny izofluranu są zbierane za pomocą systemu odprowadzającego. Gdy oddech zwierzęcia stanie się głęboki i regularny, należy wyjąć je z komory. Stopień znieczulenia należy sprawdzić za pomocą odruchu uciskania palca u stopy oraz odruchu mrugania.

Aby zapewnić pełną anestezję, należy położyć znieczulone zwierzę na brzuchu i użyć rurki respiratora do podawania 2,25% izofluranu podczas zabiegu. Buprenorfinę w stężeniu 0,1 mg/kg masy ciała należy wstrzyknąć podskórnie w kark.

Należy kontynuować monitorowanie oddechu zwierzęcia i w razie potrzeby dostosować przepływ izofluranu. Następnie należy przykleić taśmę na klatce piersiowej znieczulonego zwierzęcia i ponownie sprawdzić reakcję wycofania, uciskając tylną stopę tępą pęsetą. Za pomocą sterylnego patyczka z watą należy nałożyć grubą warstwę kremu na brzuch, upewniając się, że podszerstka jest całkowicie pokryta.

Pozostaw krem na około trzy minuty, okresowo sprawdzając stopień usuwania włosów. Za pomocą jałowego tamponu zwilż jałową gazę jałową wodą i wytrzyj włosy z brzucha. Następnie wysterylizuj miejsce nacięcia chloreksydyną i dodatkową ilością wody.

Osusz brzuch za pomocą czystej, sterylnej gazy. Powtórz ten krok, stosując 70% ethanol i świeżą, wysterylizowaną gazę bawełnianą. Przygotuj się do zabiegu, zakładając odzież chirurgiczną, aby odsłonić rogi macicy.

Najpierw zlokalizuj linea alba jako bladą linię pod skórą w linii pośrodkowej. Używając pęsety, odciągnij skórę od ściany brzusznej i wykonaj nożyczkami do skóry niewielkie, proste nacięcie od środka brzucha w dół, posiłkując się zakrzywioną pęsetą i nożyczkami. Powtórz ten proces w odniesieniu do otrzewnej. Chwyć otrzewną pęsetą.

Odsuń tkanki, a następnie wykonaj nacięcie o wielkości wystarczającej do wyciągnięcia macicy. Na nacięciu umieść sterylną gazę z małym pionowym rozcięciem i zwilż ją ciepłą sterylną solą fizjologiczną. Następnie wprowadź pęsetę do nacięcia, zlokalizuj macicę, utrzymując nacięcie otwartym za pomocą pęsety.

Chwyć macicę pomiędzy pierwszym a drugim widocznymi zarodkami i wyciągnij oba rogi macicy na gazę. Policz liczbę zarodków, odnotowując wszelkie resorpcje lub zarodki o małych rozmiarach ciała. Aby przygotować odpowiednią liczbę iniekcji DNA, zwilż rogi macicy solą fizjologiczną i ostrożnie wprowadź jeden róg macicy z powrotem do jamy brzusznej.

Aby napełnić igły chirurgiczne, należy użyć pipety z dołączonym ustnikiem, aby pobrać 10 µL roztworu DNA o stężeniu 3 mg/mL, wolnego od endotoksyn i zawierającego barwnik metylowy zielony, a następnie wprowadzić DNA do igły chirurgicznej. Pierwszą napełnioną igłę należy zamocować w mikromanipulatorze.

Ustawić się przy injektorze, zaczynając od zarodka znajdującego się najbliżej jajnika. Za pomocą pęsety okrągłej delikatnie obrócić zarodek w obrębie decyduy tak, aby był zwrócony przodem, co umożliwi wykonywanie iniekcji w kierunku od ROS (przedsionka) do pępowiny. Użyć światłowodowego źródła światła, aby zidentyfikować linię środkową mózgu zarodka.

Zwróć uwagę na obustronne powiększone komory boczne w obszarach rostralnych. Przytrzymaj embrion za pomocą zakrzywionej pęsety i ustaw wypełnioną igłę chirurgiczną nad macicą tak, aby kąt wprowadzenia do mózgu wynosił około 45 stopni. Szybkim i pewnym ruchem przekręć pokrętło mikromanipulatora, aby wprowadzić końcówkę igły przez ścianę macicy do komory bocznej mózgu embrionalnego.

Następnie naciśnij pedał mikroinkjektora. Aby wstrzyknąć roztwór DNA, należy zaobserwować rozprzestrzenianie się barwnika zieleni metylowej w komorach mózgu zarodka, co potwierdza prawidłowe wykonanie iniekcji. Po wstrzyknięciu DNA powoli wycofaj igłę, aby usunąć ją bez spowodowania uszkodzeń.

Umieść wstrzyknięty embrion na sterylnej gazie i dokładnie zwilż ciepłą solą fizjologiczną. Chwyć macicę za pomocą dodatniego bieguna elektrody płytkowej umieszczonej w wybranym miejscu transfekcji. Następnie podaj pięć kwadratowych impulsów elektrycznych o napięciu od 40 do 50 voltów i czasie trwania 50 milliseconds z częstotliwością jednego impulsu na sekundę.

Przykryj wstrzyknięty i poddany elektroporacji embrion ochronną mokrą gazą, a następnie przejdź do iniekcji kolejnego embrionu. Po zakończeniu wstrzykiwania i elektroporacji wszystkich wybranych embrionów w rogu macicy, ostrożnie wprowadź go z powrotem do jamy ciała. Wyjmij drugi róg macicy, aby rozpocząć iniekcję i elektroporację pozostałych embrionów.

Gdy wszystkie embriony znajdą się z powrotem w macicy, należy wprowadzić do jamy brzusznej od dwóch do trzech mililitrów ciepłej soli fizjologicznej, a następnie usunąć gazę z brzucha, aby odsłonić boki otrzewnej. Do zszycia otrzewnej należy użyć czarnej plecionej nici jedwabnej, zakotwicząc nić na otrzewnej najbliżej mostka i prowadząc szwy w kierunku przeciwnym do miejsca zakotwiczenia. Należy upewnić się, że wszystkie szwy są ciasne i że do otrzewnej nie zostały przyszyte leżące głębiej organy ani skóra.

Odciąć pozostałą linię szwów i usunąć ją. Za pomocą pęsety przyciągnąć skórę nad linią szwów i zamknąć ją, używając zszywek skórnych. Zeszyć skórę, uważając, aby nie zszywać linii szwów znajdującej się pod spodem oraz nie naciągać skóry zbyt mocno.

Po zakończeniu upewnij się, że zszywki są ciasne, delikatnie dociskając je za pomocą narzędzia do szycia w tym miejscu, A-P-C-I-G dwa wektory ekspresyjne sterujące ekspresją GFP zostały wprowadzone metodą elektroporacji do rozwijającej się nowokory w E 12. W miarę postępu rozwoju nowokory, progenitorzy apikalni różnicują się w wtórne progenitory bazalne lub neurony pomitotyczne i nadal wykazują ekspresję GFP. Komórki nerwowe te mogą być następnie analizowane pod kątem ekspresji typowych markerów dla podtypów neuronalnych, zaznaczonych na czerwono.

Na tym widoku brzuszno-grzbietowym przedmózgowia zarodka poddanego elektroporacji w E 12 i wypreparowanego w E 14, miejsce elektroporacji jest zaznaczone zieloną epigenitelną fluorescencją w E 14. Ekspresja GFP jest widoczna w wzgórzu, przedwzgórzu i podwzgórzu, co wskazuje, że obszary progenitorowe zostały pomyślnie przetransfekowane. Przerywana ramka oznacza miejsce przekroju przez strefę komorową.

Dokładniejsza analiza strefy komorowej wykazuje migrację komórek GFP ze strefy komorowej do strefy płaszcza. Obszar, w którym uformują się jądra podwzgórza, a także siatkówka zarodkowa, ulegają również łatwej elektroporacji, co pokazano na tym przekroju czołowym zarodka E 16.5, który został poddany elektroporacji PCIC w dniu E 15.5. Tutaj akumulacja komórek m cherry-dodatnich jest specyficzna dla zewnętrznej warstwy neuroblastów i nie występuje w komórkach zwojowych siatkówki Brn3b-dodatnich w warstwie komórek zwojowych. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w 30 minut, jeśli nie wystąpią nieprzewidziane komplikacje.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest stosowanie odpowiednich technik sterylnych, zachowanie stabilnej ręki podczas manipulowania zarodkami oraz przygotowanie wszystkich niezbędnych materiałów przed podaniem środka znieczulającego samicy. Po zakończeniu tej procedury zarodki poddane elektroplecioniu mogą rozwijać się do osiągnięcia wieku dorosłego, po czym można przeprowadzić inne badania, takie jak testy behawioralne i funkcjonalne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, jak manipulacja określonymi genami w zarodku wpływa na funkcje neuronalne u osobnika dorosłego. Od momentu opracowania technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się rozwojem OUN do badania funkcji genów in vivo u myszy.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wprowadzania obcego DNA do embrionalnej cewy nerwowej. W szczególności pokazujemy, jak przygotować ciężarną samicę do zabiegu, jak odsłonić macicę, wstrzyknąć DNA oraz przeprowadzić elektrolizę zarodka.

Należy pamiętać, że praca z fluorem może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zachować środki ostrożności, takie jak zastosowanie systemu neutralizacji gazów.