Badanie zależnej od wieku niestabilności genomicznej z wykorzystaniem modelu chronologicznej długości życia S. cerevisiae

Ogólnym celem tej procedury jest badanie zależnej od wieku niestabilności genomicznej u drożdży poprzez połączenie analizy czasu życia chronologicznego z zestawem prostych testów uszkodzeń DNA i mutacji. Cel ten osiąga się najpierw poprzez pobieranie próbek z kultur starzejących się chronologicznie co dwa dni i sprawdzanie żywotności za pomocą oznaczania jednostek tworzących kolonie (CFU). Kolejnym krokiem procedury jest badanie mutacji DNA poprzez pobieranie próbek z kultur starzejących się i wysiewanie komórek na specyficzne dla mutacji podłoże selekcyjne.

Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące zmiany w mutacjach DNA podczas chronologicznego starzenia się drożdży poprzez normalizację wyników testu mutacyjnego względem żywotności. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie starzenia, takie jak mechanizmy łączące starzenie się i niestabilność genomową w aria. Aby przeprowadzić analizę chronologicznej długości życia drożdży (CLS), należy najpierw zaszczepić pojedynczą kolonię drożdży do 1 mL syntetycznego medium kompletnego z glukozą (SDC) i inkubować przez noc z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C. Następnego dnia rozcieńczyć kulturę nocną w 10 mL świeżego medium SDC do wartości OD 600 od 0,05 do 0,1 i inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przez trzy dni.

W trzeciej dobie, gdy komórki znajdują się w fazie stacjonarnej, należy rozcieńczyć każdą próbkę Eloqua 10 000 razy w wodzie autoklawowanej, a następnie pobrać dwie alikwoty po 10 µL z kolby i wysiać po 10 µL każdej rozcieńczonej kultury na płytkę A-Y-E-P-D. Płytkę inkubuje się w temperaturze 30 °C do momentu pojawienia się kolonii. Liczbę powstałych kolonii lub jednostek tworzących kolonie z kultury z trzeciej doby uznaje się za 100% przeżywalności.

Kontynuuj pobieranie aliquotów z kultury starzejącej się w kolejnych dniach w celu wysiewania. Dostosuj odpowiednio czynniki rozcieńczenia, aby zapewnić obecność od 20 do 100 kolonii w teście CFU. Pobieranie próbek kończy się, gdy żywotność kultury spadnie poniżej 1% – zazwyczaj między 11. a 13. dniem; żywotność komórek można również badać w komórkach starzejących się na płytkach.

Aby rozpocząć ten test, należy zaszczepić pojedynczą kolonię w jednym mililitrze syntetycznego podłoża kompletnego z glukozą i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C przy jednoczesnym wytrząsaniu. Gdy kultura osiągnie gęstość około 10⁸ komórek na mililitr, należy rozcieńczyć ją wodą autoklawowaną do stężeń od 100 do 200 komórek na 10 µL oraz 1000 komórek na 10 µL. Dla każdego szczepu należy przygotować zestaw od 8 do 20 płytek SDC z pominięciem tryptofanu, oznakowanych zgodnie z gęstością wysiewu.

Aby zapewnić możliwość przeliczenia od 10 do 100 kolonii, przewidując spadek żywotności w miarę starzenia się, nanieś dwie alikwoty od 10 do 30 µL rozcieńczonej kultury na każdą płytkę. Inkubuj zestaw płytek w temperaturze 30 °C przez cały czas trwania analizy długości życia; w dniu wysiewu oraz co dwa kolejne dni wyjmij jedną płytkę i dodawaj kroplami 0,5 ml tryptofanu, aby umożliwić wzrost żywych komórek. Inkubuj płytkę w temperaturze 30 °C przez kolejne 48 do 72 godzin.

Po 48 do 72 godzin należy policzyć CFU, aby ocenić żywotność w dniu dodania tryptofanu do testu w celu analizy uszkodzeń DNA i częstotliwości mutacji podczas starzenia chronologicznego. W teście CLS dla drożdży równolegle z szczepem typu dzikiego hoduje się szereg szczepów o specyficznych cechach.

Częstość spontanicznych mutacji można ocenić, mierząc częstość powstawania oporności na kanawaninę w kulturze starzejącej się chronologicznie. Mutacje w genie can1, który koduje plazmatyczną permeazę argininy, sprawiają, że komórki stają się oporne na analog argininy, L-kanawaninę. Komórki oporne na kanawaninę będą rosły na płytkach z syntetycznym medium kompletnym pozbawionym argininy, uzupełnionym o siarczan L-kanawaniny. Pomiar częstości rewersji tryp+, w szczepie zawierającym mutację bursztynową w sekwencji kodującej gen trp1, pozwala na oszacowanie tempa substytucji zasad podczas chronologicznego starzenia się drożdży.

Komórki z pozytywną rewersją będą rosły na płytkach z brakiem tryptofanu. Negatywny szczep lizujący EH1-50 posiada przesunięcie o +4 w otwartej ramce odczytu, co prowadaje do autofagii lizyny; może to zostać odwrócone poprzez niewielkie mutacje insercyjne lub delecyjne. Rewertanty zostaną wyselekcjonowane na płytkach z brakiem lizyny w celu wykrycia dużych reorganizacji chromosomowych (gcr).

Wykorzystano szczep mutant, w którym HX T 13 zlokalizowany 7,5 kilobaz telomerycznie względem can1 na chromosomie 5 jest przerwany kasetą U3. Mutacje w obu genach, can1 i U3, czynią komórki odpowiednio opornymi na L-kanawaninę i kwas 5-fluorootarowy. Ponieważ częstotliwość mutacji punktowych występujących w obu genach jest niska, analiza częstotliwości oporności zarówno na L-kanawaninę, jak i kwas 5-fluorootarowy pozwala na oszacowanie gcr w celu monitorowania poziomu rekombinacji homologicznej i niehomologicznej. W czasie starzenia chronologicznego generowane są mutanty posiadające albo 100% homologiczne odwrócone powtórzenia, albo 91% homologiczne.

Rekombinacja między sekwencjami IRS w locus his3 umożliwia ekspresję funkcjonalnego białka his3. W związku z tym komórki, w których doszło do rekombinacji, będą rosły na płytkach z pożywką pozbawioną histydyny, uzupełnionej o galaktozę. Trzeciego dnia, gdy komórki znajdą się w fazie stacjonarnej, z każdej hodowli starzejącej się zostanie pobrana odpowiednia ilość komórek.

Ponieważ dla wszystkich testów stosowana jest ta sama procedura, przetworzona zostanie tylko jedna próbka. Na potrzeby tego filmu należy odwirować komórki w wirówce nakładkowej w celu uzyskania osadu. Odlać supernatant i resuspender komórki w 1 mL wody autoklawowanej.

Ponownie usuń supernatant i resuspender osad komórkowy w 100 µL wody; wysiej komórki na odpowiednie płytki, aby wyselekcjonować pożądane rewerty. Inkubuj płytki w temperaturze 30 °C; po trzech do czterech dniach policz CFU, a następnie znormalizuj częstość mutacji do liczby żywych komórek. Ten wykres przedstawia reprezentatywne wyniki typowego testu długości życia chronologicznego, w którym przeżywalność chronologiczna komórek typu dzikiego jest porównywana z przeżywalnością mutantów S CH nine delta TOR one delta oraz RAs two delta.

W hodowli płynnej mutanty pozbawione TOR1, SCH9 lub RAS2 wykazują wydłużoną chronologiczną długość życia. Co więcej, niedobory SCH9 i RAS2 wykazują efekt addytywny w promowaniu długowieczności i przeżywalności chronologicznej w obecności różnych źródeł węgla. Zastosowanie testu żywotności NC2 przedstawiono na następnym wykresie.

Pierwszego dnia hodowle szczepu dzikiego SDC rozcieńczono i wysiano na płytki SC trip dropout bez źródła węgla. Płytki SC Tripp dropout uzupełnione o glukozę, etanol lub glicerol inkubowano w temperaturze 30 °C przez dwa dni. Z każdego zestawu wybrano jedną płytkę i dodano odpowiednie składniki odżywcze, aby umożliwić wzrost i tworzenie kolonii.

Częstotliwość mutacji zależna od wieku znacznie różni się w zależności od szczepu, tła, manipulacji genetycznych, hodowli, warunków i wieku. Tabela ta przedstawia typowe wyniki uzyskane w szczepie typu dzikiego. Reprezentatywne wyniki syntezy ponad uszkodzeniem (trans lesion synthesis) przedstawiono na następnym obrazie.

Wzrost częstotliwości mutacji zależny od wieku może wiązać się ze zmianami w błędnej naprawie DNA z wykorzystaniem ekstraktów jądrowych i różnych matryc DNA. Możemy ocenić syntezę translacyjną lub TLS w komórkach w wieku chronologicznym. Przeanalizowano ekstrakty jądrowe z trzydniowych komórek w fazie stacjonarnej typu dzikiego oraz mutantów SCH9Δ.

Produkty TLS z nieuszkodzonym matrycą są oznaczone liniami ciągłymi, a produkty TLS z uszkodzoną matrycą liniami przerywanymi. W ekstraktach jądrowych z długowiecznego mutanta s CH nine delta nie zaobserwowano syntezy przez uszkodzenie; wolne primery są oznaczone otwartą strzałką. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat przeprowadzania analizy długości życia chronologicznego oraz mutacji DNA u drożdży.