Zastosowanie trwałego podwiązania środkowej tętnicy mózgowej u myszy
25 lipca 2011
Podwiązanie tętnicy środkowej mózgu (MCA) jest techniką służącą do badania ogniskowego niedokrwienia mózgu w modelach zwierzęcych. W tej metodzie tętnica środkowa mózgu zostaje odsłonięta poprzez kraniotomię, a następnie podwiązana za pomocą kauteryzacji. Metoda ta zapewnia wysoką powtarzalność objętości zawału oraz zwiększoną przeżywalność pooperacyjną w porównaniu z innymi dostępnymi metodami.
Ogólnym celem tej procedury jest badanie ogniskowego niedokrwienia mózgu w modelach zwierzęcych. Realizuje się to poprzez wykonanie najpierw niewielkiego nacięcia skóry pomiędzy lewym okiem a nasadą ucha. Następnie, w miejscu połączenia łuku jarzmowego z kością łuską, wykonuje się kraniotomię w celu odsłonięcia tętnicy środkowej mózgu, która następnie zostaje podwiązana przy użyciu kauteryzatora naczyń krwionośnych.
Na koniec skórę zszywa się, aby zamknąć ranę. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące obszar zawału zlokalizowany w lewej półkuli mózgu myszy. Mózg można zabarwić TTC lub poddać badaniu MRI w celu wizualizacji udaru.
Mózg po udarze może być również wykorzystany do oznaczenia ekspresji białek lub mRNA. Cześć, nazywam się Garza Chola. Jestem studentem studiów doktoranckich w laboratorium Gale Johnson na Uniwersytecie w Rochester.
Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie udarów, takie jak zilustrowanie mechanizmów prowadzących do śmierci komórek w niedokrwionym mózgu. Aby przygotować się do operacji, należy wysterylizować wszystkie instrumenty chirurgiczne, gazy i aplikatory poznawcze w autoklawie. Narzędzia chirurgiczne należy przechowywać w 70% ethanol podczas operacji i osuszać na sterylnej gazie bezpośrednio przed użyciem.
Na dwie godziny przed operacją spryskaj obszar roboczy 70% ethanol. Wstrzyknij myszy buprenorfinę w dawce 0,05 mg/kg. Lek zostanie podany ponownie natychmiast po operacji, a następnie co trzy do pięciu godzin w ciągu pierwszych 24 godzin okresu pooperacyjnego.
Użyj parownika anestetycznego, aby znieczulić mysz mieszaniną 3% izofluranu i 20% tlenu. Dostosuj ilość tlenu za pomocą przepływomierza. Sprawdź poziom znieczulenia poprzez uciśnięcie palca stopy lub ogona.
Utrzymaj poziom znieczulenia za pomocą 2% izofluranu. Do oczu myszy zastosuj sztuczne łzy, zachowując ostrożność, aby nie uszkodzić oka podczas procedury chirurgicznej.
Umyj mysz na prawym boku w pozycji bocznej, używając trymera do zwierząt. Wygol obszar po lewej stronie między lewym okiem a nasadą lewego ucha. Oczyść ten obszar, naprzemiennie stosując roztwór Betadiny i 70% ethanol, przecierając go delikatnie za pomocą patyczków higienicznych.
Konieczne jest powtórzenie procedury. Umieść mysz na podkładce grzewczej połączonej z sondą rektalną. Aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C, wprowadź sondę rektalną, używając oleju mineralnego. Ułóż mysz na prawym boku pod mikroskopem i zabezpiecz taśmą.
Wytnij otwór w gazie chirurgicznej i osłoń obszar operacyjny za pomocą precyzyjnych nożyczek prostych. Wykonaj nacięcie pionowe między lewym okiem a podstawą lewego ucha. Użyj zakrzywionych kleszczyków hemostatycznych, aby utrzymać dostęp do pola operacyjnego w przypadku nadmiernego wysychania tkanek podczas zabiegu.
Za pomocą aplikatorów z bawełnianym końcem nanieś sterylny PBS. Używając nożyczek sprężynowych, wykonaj poziome nacięcie mięśnia skroniowego, a następnie powoli odciągnij go pęsetą, aby lekko oddzielić mięsień skroniowego od czaszki. Przytrzymaj kość żuchwy zakrzywioną pęsetą i za pomocą igły 18G wykonaj niewielką subtemporalną kraniotomię w miejscu połączenia łuku jarzmowego z łuską kości skroniowej.
Za pomocą wiertarki kostnej usuwa się niewielkie fragmenty czaszki, aby odsłonić MCA. Podczas tego procesu nie należy uszkodzić łuku jarzmowego ani zawartości oczodołu. Używając małego kauteryzatora naczyń, podwiązuje się dystalną część MCA, umieszcza mięsień skroniowy z powrotem w pierwotnej pozycji i stosuje szwy nylonowe 5-0.
Aby zamknąć miejsce nacięcia, przerwać znieczulenie i usunąć sondę odbytniczą. Podać myszy podskórnie drugą dawkę buprenorfiny. Przenieść mysz z powrotem do klatki, która była utrzymywana w temperaturze 37 °C.
Z zastosowaniem panelu grzewczego. Przez następne 24 godziny należy uważnie monitorować mysz pod kątem wszelkich oznak dyskomfortu, w tym spadku apetytu lub zmniejszonego spożycia wody, zgarbionej postawy, przyspieszonego oddechu lub zjeżonej sierści. Bezpośrednio po zabiegu należy podać myszy żel regeneracyjny.
Odczekać od dwóch do trzech godzin po operacji. Następnie wstrzyknąć myszy buprenorfinę podskórnie co trzy do pięciu godzin przez maksymalnie 24 godziny. 24 godziny po operacji głęboko znieczulić mysz i przeprowadzić perfuzję 4%TTC.
Usuń mózg i umieść go w 4% roztworze paraformaldehydu na całą noc. Następnego dnia umieść mózg w bloku do sekcjowania. Użyj żyletek, aby pokroić mózg w plastry o grubości 1 mm.
Umieść plastry obok linijki milimetrowej. Używając aparatu cyfrowego podłączonego do mikroskopu stereoskopowego, wykonaj zdjęcia plastrów w oprogramowaniu ImageJ.
Kliknij menu plik i otwórz wybrany plik zdjęcia. Kliknij kartę linii prostych w programie. Narysuj linię prostą pomiędzy dwoma marginesami na linijce.
Kliknij menu Analyze i wybierz opcję Set Scale. Ustaw znaną odległość jako 1, a jednostkę długości jako milimetr. Kliknij kartę Freehand Circle.
Narysuj okrąg, aby obrysować przeciwległą półkulę. Kliknij menu analyze i wybierz measure. Pojawi się okno obliczeń wyświetlające pole powierzchni narysowanego okręgu.
Narysuj kolejny okrąg wokół półkuli ipsilateralnej, z wyłączeniem obszaru białego obrysu. Zmierz powierzchnię w sposób opisany wcześniej. Nowa wartość zostanie dodana do okna obliczeń.
Różnica między pierwszą a drugą wartością reprezentuje obszar zawału. Oblicz powierzchnię udaru w każdym przekroju, powtarzając powyższe kroki dla grubości przekroju wynoszącej 1 mm. Oblicz objętość udaru poprzez zsumowanie powierzchni udaru obliczonej dla każdego przekroju.
Rysunek ten przedstawia barwienie TTC mózgu 24 godziny po trwałej ligacji tętnicy środkowej mózgu (MCA) u myszy linii C 57 BL six typu dzikiego. Obszar udaru ma biały kolor i jest widoczny przy różnych powiększeniach i pod różnymi kątami. Przedstawione tutaj plastry o grubości jednego milimetra z mózgu z udarem barwionego TTC pokazują obszar zawału od strony przedniej do tylnej.
Objętość obliczono 24 godziny po operacji. Objętość obszaru zawału wynosi około 23 milimetrów sześciennych. Technikę tę można wykonać w 30 minut, jeśli zostanie ona przeprowadzona prawidłowo.
Dziękujemy za oglądanie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Technika podwiązania tętnicy środkowej mózgu (MCA) jest wykorzystywana do badania ogniskowego niedokrwienia mózgu w modelach zwierzęcych. Metoda ta polega na odsłonięciu i podwiązaniu tętnicy środkowej mózgu, co pozwala na uzyskanie powtarzalnych objętości zawału oraz poprawę wskaźnika przeżywalności po operacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Badania nad udarem mózgu
- Modele zwierzęce
Wprowadzenie
- Ogniskowe niedokrwienie mózgu jest kluczowym obszarem badań w zrozumieniu udaru.
- Metoda podwiązania tętnicy środkowej mózgu (MCA) umożliwia prowadzenie kontrolowanych eksperymentów.
- Modele zwierzęce pozwalają na poznanie mechanizmów udaru u ludzi.
- Poprawa wskaźników przeżywalności zwiększa wiarygodność wyników.
Cel badania
- Zbadanie skutków ogniskowego niedokrwienia mózgu.
- Ocena objętości obszarów zawału w kontrolowanych warunkach.
- Pogłębienie zrozumienia patologii udaru.
Zastosowane metody
- Nacięcie wykonano pomiędzy lewym okiem a podstawą ucha.
- Kraniotomię przeprowadzono na wysokości łuku jarzmowego i kości łuskowej.
- Tętnicę mózgową środkową podwiązano przy użyciu kauteryzatora do małych naczyń.
- Po zakończeniu procedury ranę zamknięto poprzez zaszycie skóry.
Główne wyniki
- Zawał zlokalizowany w lewej półkuli mózgu myszy.
- Wizualizacja udaru uzyskana poprzez barwienie TTC lub MRI.
- Wyniki wykazują skuteczność techniki ligacji MCA.
- Odnotowano wysoką powtarzalność objętości zawałów.
Wnioski
- Ligacja tętnicy środkowej mózgu (MCA) jest niezawodną metodą badania ogniskowego niedokrwienia mózgu.
- Wyższe wskaźniki przeżywalności wpływają na wiarygodność wyników.
- Technika ta może być wykorzystana do dalszych badań nad terapiami udarów.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model permanentnego podwiązania środkowej tętnicy mózgowej zapewnia powtarzalny system badania ogniskowego niedokrwienia mózgu, umożliwiając mechanistyczną ocenę ryzyka związanego z neuroprotekcyjnymi związkami w przedklinicznych badaniach nad udarem. Poprzez generowanie spójnych objętości zawałów u myszy, metoda ta wspiera walidację celów oraz rozwój testów dla kandydatów na leki adresujących niezaspokojone potrzeby w leczeniu udaru niedokrwiennego. Jej istotność w kontekście patologii ludzkiej — gdzie około 80% udarów występuje w obszarze MCA — zwiększa pewność translacyjną i usprawnia selekcję projektów w fazie wczesnego odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w szlakach niedokrwiennych poprzez kontrolowaną indukcję niedokrwienia ogniskowego.
- Wartość naukowa: Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez wyjaśnienie roli celu w tworzeniu rdzenia zawału i penumbry.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną kwantyfikację zawału za pomocą barwienia TTC, co ułatwia spójną ocenę oddziaływania na cel.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do przesiewania związków poprzez ustanowienie modelu niedokrwienia istotnego w kontekście choroby.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pomiar obszaru zawału za pomocą wolumetrii opartej na TTC, umożliwiając ilościową analizę zależności dawka-odpowiedź.
- Wartość operacyjna: Zwiększa powtarzalność analizy dzięki przeżywalności na poziomie ~80%, co redukuje zmienność wyników farmakologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje patologię udaru u ludzi z wysoką istotnością anatomiczną i patofizjologiczną w odniesieniu do zawałów w obszarze tętnicy środkowej mózgu (MCA).
- Wartość naukowa: Umożliwia ocenę mechanizmów odpowiedzi na hipoksję wewnątrzkomórkową in vivo, wspierając odkrywanie biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki zestandaryzowanym protokołom chirurgicznym i barwieniu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje proces odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne testy skuteczności, zapewniając platformę do ograniczania ryzyka mechanistycznego w badaniach nad terapiami udaru.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących celów neuroprotekcyjnych poprzez umożliwienie kontrolowanego niedokrwienia oraz ilościowego określenia obszaru zawału.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanemu barwieniu TTC, generując ilościowe wyniki objętości zawału do oceny związków.
- Analityka: Generuje pomiary objętościowe (np. zawał ~23 mm³ po 24h), które umożliwiają porównanie między różnymi warunkami i określenie wielkości efektu.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną dzięki lokalizacji zawału odzwierciedlającej wzorce udaru u ludzi, co wspomaga rozwój badań z uwzględnieniem analizy ryzyka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do oceny wielu związków w różnych projektach ze względu na powtarzalność i standaryzowane punkty końcowe.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach niedokrwiennych.
- Wartość operacyjna: zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanym procedurom kraniotomii, ligacji oraz barwienia TTC.
- Wartość strategiczna: usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie wiarygodnych danych o obszarze zawału, co zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach programów badań nad udarem.
- Wpływ na portfolio: umożliwia priorytetyzację kandydatów na leki neuroprotekcyjne z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o spójne sygnały skuteczności przedklinicznej.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgii gryzoni oraz neuroanatomicznej identyfikacji MCA.
- Zależne od instrumentarium mikrochirurgicznego, w tym koagulatorów naczyń, podgrzewaczy oraz precyzyjnych narzędzi do szycia.
- Wymaga standaryzacji protokołów znieczulenia, analgezji oraz monitorowania pooperacyjnego pomiędzy zespołami.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania technik przy przejściu z modeli szczurzych na mysie, w tym w zakresie rozmiaru szwu i precyzji okluzji.
- Ograniczone koniecznością zastosowania punktów końcowych w celu przeprowadzenia ilościowej oceny zawału za pomocą barwienia TTC lub MRI.
