Aseptyczne techniki laboratoryjne: metody galwanizacji

[Narrator] Niniejszy protokół obejmuje techniki aseptyczne w metodach wysiewu stosowanych do izolacji, namnażania lub enumeracji mikroorganizmów, takich jak bakterie i fagi. Procedury obejmują wysiew metodą smugową kultur bakteryjnych w celu izolacji pojedynczych kolonii. Metodę wysiewu wgłębnego w celu oznaczenia stężenia bakterii. Oraz metodę wysiewu powierzchniowego do enumeracji żywych kolonii bakteryjnych. Nakładki z miękkiego agaru są wykorzystywane do izolacji fagów i enumeracji placków, natomiast wysiew replikacyjny umożliwia przenoszenie komórek z jednej płytki na drugą w identycznym układzie przestrzennym. W ostateczności praktyczne zastosowania tych technik hodowli mikroorganizmów obejmują zakres od identyfikacji bakterii w środowisku po postępy technologiczne w genetyce molekularnej i wysokoprzepustowych bioanalizach.

- Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tymi metodami wysiewu mogą napotkać trudności, ponieważ manipulacje wymagają ostrożnych i skoordynowanych ruchów, aby uniknąć kontaktu z niejałowymi powierzchniami. Opanowanie tych rutynowych procedur wymaga szkolenia i praktyki. Procedury zaprezentuje koordynator mojego laboratorium, dr Kris Reddi.

- [Narrator] Pracę z mikroorganizmami należy rozpocząć od zapoznania się z zasadami laboratoryjnymi i środkami ostrożności, w tym z klasyfikacją zagrożeń biologicznych, dekontaminacją odpadów oraz ich utylizacją. Należy potwierdzić, że wszystkie instrumenty, roztwory i pożywki do procedur wysiewu są sterylne. Należy również przygotować czysty obszar roboczy i zdezynfekować go środkiem odkażającym. Należy przygotować palnik Bunsena z rurką podłączoną do linii gazowej oraz ułożyć niezbędne materiały, odpowiednio je etykietując. Następnie należy dokładnie umyć ręce mydłem antyseptycznym i ciepłą wodą. Najpierw zmocz ręce ciepłą, bieżącą wodą, a następnie nałóż i dokładnie rozprowadź mydło. Intensywnie pocieraj ręce, wywołując tarcie na wszystkich powierzchniach, w tym na kciukach, grzbietach palców, wierzchu dłoni i pod paznokciami. Następnie dokładnie spłucz ręce, aby usunąć pozostałości mydła, i osusz je ręcznikami papierowymi z dozownika. Na koniec, używając świeżego ręcznika papierowego, zakręć kran. Procedura wysiewu metodą smugową służy do izolacji czystych kultur bakterii, czyli kolonii, z populacji mieszanych poprzez proste rozdzielenie mechaniczne. Wyjmij płytkę z agarem z chłodni o temperaturze 4 °C i ogrzej ją do temperatury pokojowej. Wybierz odpowiednie narzędzie z zestawu instrumentów do smugowania płytki. Upewnij się, że płytka jest sucha i na pokrywce nie ma kondensacji. Opisz dno płytki z agarem wzdłuż jej krawędzi. Po nabyciu wprawy można używać jednej płytki dla wielu próbek. Następnie zapal palnik Bunsena, aby wysterylizować pętlę metalową w płomieniu. Zacznij od odległości trzech do czterech cali od pętli, umieszczając drut w czubku niebieskiego stożka, czyli w najgorętszej części płomienia palnika Bunsena. Gdy metal rozżarzy się do czerwoności, przesuń drut tak, aby płomień objął pętlę. Aby schłodzić pętlę, dotknij krawędzi podłoża agarowego, co wywoła syczenie. Następnie pobierz inokulum na pętlę. Unieś dolną połowę płytki. Poruszaj pętlą w przód i w tył od krawędzi do środka w pierwszym kwadrancie płytki. Odłóż odwróconą płytkę na pokrywkę. Ponownie wysterylizuj pętlę w płomieniu. Obróć szalkę Petriego o 90 stopni. Dotknij pętlą miejsca w pobliżu końca ostatniej smugi, stosując wzór ruchów w przód i w tył, przecinając ostatnią połowę smug w pierwszym kwadrancie, a następnie przejdź do pustego drugiego kwadrantu. Po wypełnieniu drugiego kwadrantu odłóż płytkę. Powtórz procedurę smugowania dla trzeciego i czwartego kwadrantu, unikając kontaktu z pierwszym kwadrantem. W przypadku smugowania za pomocą sterylnej, płaskiej wykałaczki, trzymaj wąski koniec delikatnie między kciukiem a palcem serdecznym pod kątem 10 do 20 stopni względem podłoża, a szerokiego końca używaj do smugowania kwadrantów. Odwróć płytkę na pokrywkę pomiędzy kwadrantami i odpowiednio zutylizuj wykałaczkę. Następnie inkubuj wysiewane płytki w pozycji odwróconej. Procedura wysiewu metodą wlewaniem pozwala na wyliczenie całkowitej liczby jednostek tworzących kolonie na powierzchni i wewnątrz agaru na pojedynczej płytce. Nastaw timer na 10 minut, a następnie przenieś 18 mL stopionego podłoża agarowego z łaźni wodnej o temperaturze 55 °C do bloku grzejnego o temperaturze 48 °C i pozostaw na 10 minut w celu wyrównania temperatury. Opisz dno sterylnej szalki Petriego. Jeśli jest to wymagane, podaj czynnik rozcieńczenia. Teraz nlej 1 mL próbki na środek szalki Petriego. Zamknij pokrywkę. Zdejmij korek z probówki ze stopionym agarem i przejdź krawędzią otwartej probówki przez płomień. Ostrożnie wlej agar do szalki Petriego. Zamknij pokrywkę, a następnie wymieszaj próbkę z agarem, delikatnie obracając płytkę kolistymi ruchami. Odczekaj 30 minut, aż agar stężeje. Po zastygnięciu agaru odwróć płytkę i umieść ją w ciepłym pomieszczeniu. Wysiew metodą rozlewania ma na celu rozdzielenie mikroorganizmów zawartych w małej objętości próbki i równomierne rozłożenie powstałych kolonii na powierzchni agaru. Doprowadź płytkę do temperatury pokojowej i odpowiednio ją opisz. Umieść płytkę na obrotowym stole. Pipetuj 0,1 mL próbki na środek agaru i zamknij pokrywkę. Wyrzuć końcówkę do pojemnika na odpady. Zanurz metalowy rozpylacz w zlewce z 70% etanolem, pokrywając całą dolną część rozpylacza i pierwszy cal trzpienia, a następnie odcedź. Odpal nadmiar etanolu, przeprowadzając go przez płomień palnika Bunsena. Następnie otwórz pokrywkę płytki z agarem i schłódź rozpylacz, dotykając agaru wzdłuż krawędzi przy brzegu. Powoli obracaj stołem obrotowym. Trzymając rozpylacz delikatnie na powierzchni agaru, stopniowo i równomiernie rozprowadź próbkę na całej płytce, wykonując ruchy w przód i w tył podczas obrotu stołu. Zamknij pokrywkę i pozostaw próbkę do całkowitego wchłonięcia przez co najmniej pięć minut. Następnie inkubuj odwróconą płytkę. Najpierw odpowiednio opisz płytkę z agarem. Otwórz pokrywkę płytki z agarem. Następnie otwórz pojemnik z wstępnie sterylizowanymi szklanymi kuleczkami i wysterylizuj krawędź w płomieniu. Ostrożnie nanieś 10 do 12 sterylnych szklanych kuleczek na płytkę z agarem. Zamknij pokrywkę płytki i wysterylizuj krawędź pojemnika z kuleczkami przed ponownym założeniem korka. Teraz pipetuj próbkę na środek agaru. Wykonując ruch poziomy, delikatnie potrząśnij kuleczkami po powierzchni agaru siedem razy. Jeśli procedura jest wykonana prawidłowo, dźwięk przypomina potrząsanie marakasami. Obróć płytkę o 60 stopni i ponownie potrząśnij poziomo siedem razy. Ponownie obróć płytkę o 60 stopni i powtórz potrząsanie. Upewnij się, że próbka została wchłonięta. Następnie zlej zanieczyszczone kuleczki do oznakowanej zlewki zbiorczej zawierającej 10% wybielacza chlorowego. Inkubuj odwróconą płytkę. Test plackowy jest powszechnie stosowany do wykrywania i ilościowego oznaczania bakteriofagów. Hoduj bakterie wskaźnikowe do fazy wykładniczej i przechowuj na lodzie. Następnie opisz dwie sterylne probówki do mikrocentryfugi jako „fag” i „kontrola” i dodaj odpowiednio 50 µL próbki faga lub buforu do każdej z nich. Następnie zamieszaj kulturę bakteryjną w kolbie, przenieś alikwot bakterii do sterylnej probówki i delikatnie wymieszaj bakterie wskaźnikowe w wortexie, a następnie dodaj 500 µL bakterii do każdej probówki do adsorpcji. Wymieszaj, delikatnie stukując probówkami o dłoń. Nigdy nie używaj wortexu ani nie pipetuj energicznie próbek fagowych. Inkubuj mieszaninę faga i bakterii w temperaturze odpowiedniej dla szczepu wskaźnikowego przez 20 minut. W międzyczasie przenieś dwie probówki z miękkim agarem z łaźni wodnej o temperaturze 55 °C do bloku grzejnego o temperaturze 48 °C. Wyrównaj temperaturę przez 10 minut. Opisz dwie wolne od kondensacji płytki z twardym agarem odżywczym, uprzednio ogrzane do temperatury pokojowej. Wyjmij probówkę z miękkim agarem z bloku grzejnego i sprawdź, czy zawartość nie jest zbyt gorąca w dotyku. Następnie aseptycznie przenieś mieszaninę z probówki adsorpcyjnej z fagiem do probówki z miękkim agarem. Następnie szybko obracaj probówką między dłońmi, aby wymieszać zawartość. Trzymając probówkę w jednej ręce, otwórz pokrywkę płytki z twardym agarem drugą ręką. Natychmiast wlej całą zawartość probówki na powierzchnię płytki z twardym agarem. Szybko i delikatnie kołysz płytką. Zamknij pokrywkę i pozostaw płytkę w poziomie na 30 minut, aż miękki agar stężeje. Następnie powtórz procedurę dla probówki adsorpcyjnej kontrolnej, przenosząc mieszaninę kontrolną do probówki z miękkim agarem. Wymieszaj ją, wlej zawartość na płytkę z twardym agarem, zakołysz ją i pozwól miękkiemu agarowi stężeć przez 30 minut. Sprawdź płytki pod kątem tworzenia się placków. Aby wyizolować plack z mieszaniny heterogenicznej, ostrożnie przebij jego środek sterylną wykałaczką i przenieś inokulum do sterylnej probówki do mikrocentryfugi zawierającej 100 µL buforu fagowego. Kontynuuj oczyszczanie tego lizatu, powtarzając test plackowy od trzech do sześciu razy z rozcieńczeniami seryjnymi w razie potrzeby. Wysiew metodą replikacji wykorzystuje fenotyp selekcjonowalny, umożliwiając porównanie wzrostu komórek na płytce pierwotnej z płytkami wtórnymi. Narysuj siatkę na dnie płytki, opisz płytkę pierwotną i ponumeruj powstałe kwadraty. Teraz, stosując technikę aseptyczną, wyjmij wstępnie sterylizowaną wykałaczkę ze zlewki, dotknij środka każdego kwadratu próbką komórek i zutylizuj wykałaczkę w odpowiednim pojemniku na odpady. Inkubuj płytkę pierwotną. Ustaw płytkę pierwotną i wszystkie płytki wtórne w stos. Umieść znacznik orientacyjny na boku dolnej połowy płytek. Teraz wyjmij sterylną tkaninę welurową z opakowania i umieść ją na cylindrycznym bloku. Następnie załóż uchwyt, dopasowując znaczniki na uchwycie do tych na bloku. Zwróć uwagę na znacznik orientacyjny na bloku i uchwycie. Następnie zdejmij pokrywkę z płytki pierwotnej. Dopasuj znaczniki orientacyjne na płytce i bloku. Opuść płytkę tak, aby powierzchnia agaru zetknęła się z tkaniną welurową. Używając opuszków palców, lekko, ale równomiernie dociśnij tył płytki pierwotnej, a następnie ostrożnie zdejmij ją z bloku. Potwierdź, że na welurze widać odcisk komórek. Załóż pokrywkę na płytkę. Teraz sekwencyjnie powtórz protokół na tkaninie welurowej z każdą z płytek wtórnych. Użyj odcisku komórek z płytki pierwotnej na welurze, aby zaszczepić do ośmiu płytek wtórnych, ułożonych od podłoża najmniej do najbardziej sprzyjającego. Na koniec, jako kontrolę pozytywną, dla ostatniej płytki w serii użyj podłoża agarowego, na którym powinny rosnąć wszystkie testowane szczepy. Sklej odwrócone płytki taśmą i inkubuj je. Sprawdź wzrost na płytkach wtórnych. Wyłącz palnik Bunsena, a następnie uprzątnij wszystkie materiały. Umieść zanieczyszczoną odzież laboratoryjną, szkło i odpady niebezpieczne w odpowiednim pojemniku do utylizacji. Oczyść obszar roboczy środkiem dezynfekującym. Na koniec dokładnie umyj ręce mydłem antyseptycznym i ciepłą wodą. Serratia Marcescens to gram-ujemna, pałeczkowata proteobakteria, która produkuje czerwonawy pigment zwany prodigiozyną. Często występuje w łazienkach i na zasłonach prysznicowych. W tym przykładzie technika wysiewu smugowego generuje pojedyncze kolonie w czwartym kwadrancie. Ta analiza bakterii obecnych w próbce wody pobranej z publicznej fontanny do picia wykorzystuje technikę wysiewu metodą wlewaniem. Zauważ różnicę w wyglądzie kolonii. Kolonie powierzchniowe są duże i okrągłe, podczas gdy niektóre kolonie powierzchniowe są bardzo małe i mają nieregularny kształt. Technika wysiewu metodą rozlewania jest ważnym elementem doświadczeń wzbogacania, selekcji i przesiewania. Na przykład metoda Copacabana jest narzędziem różnicującym w klasycznym przesiewie niebiesko-białym w technologii rekombinowanego DNA. Fag T4 to wirulentny fag o dwuniciowym DNA, który infekuje swojego gospodarza Escherichia coli, aby go lizować i uwalniać potomne fagi. Ten test plackowy na agarze EHA pokazuje fagi w strefach przejaśnienia o średnicy około 1 mm. W przypadku braku infekujących cząsteczek faga wzrost bakterii skutkuje mętna zawiesiną komórek w miękkim agarze, w której nie są widoczne odrębne kolonie. W technice nakładania miękkiego agaru morfologia placków może się różnić. Na przykład tutaj ten sam szczep gospodarza mycobacterium produkuje odmienne morfologie placków w obecności niszczycieli fagów microbacteria w przeciwieństwie do fagów mycobacteria MSSS. Siła wysiewu metodą replikacji tkwi w jednoczesnym przesiewaniu dużej liczby mikroorganizmów. W tym przypadku cztery szczepy pseudomonas zostały przetestowane w dubletach pod kątem wzrostu na trzech różnych źródłach węgla: acetamidzie, laktozie i glicynie. Tutaj płytka pierwotna zawiera kompletne podłoże YTA zaszczepione czterema wskazanymi szczepami. Szczepy wykazują zmienne wzorce wzrostu na płytkach replikacyjnych z minimalnego podłoża MSA uzupełnionego o pojedyncze źródło węgla: acetamid, laktozę lub glicynę. Wszystkie szczepy rosną na ostatniej płytce kontrolnej pozytywnej, co potwierdza, że komórki zostały przeniesione na wszystkie płytki wtórne w tej serii. Tabulacja wyników tych płytek replikacyjnych szczegółowo przedstawia jednoczesne przesiewanie różnych szczepów typu dzikiego pod kątem charakterystycznych wymagań wzrostowych.

- Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzać procedury wysiewania bez zanieczyszczania pożywek lub kultur, a także jak dobrać odpowiednią metodę wysiewania do każdego konkretnego zadania eksperymentalnego w laboratorium. Osiągnięcie biegłości w tych technikach wymaga praktyki. Jednak dzięki odpowiedniemu przeszkoleniu procedury wysiewania opisane w tym filmie staną się naturalnym elementem pracy przy stole laboratoryjnym.