Supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie testu supresji in vitro dla ludzi do pomiaru funkcji komórek treg oraz potencjalnego przewidywania przyszłej utraty ich funkcji. Osiąga się to poprzez przygotowanie i przetestowanie zakodowanych kulek, które posłużą jako stymulatory komórkowe. Drugim krokiem jest izolacja czystych naiwnych limfocytów T CD4+ CD25-, aktywowanych in vivo limfocytów T CD4+ CD25low oraz regulatorowych limfocytów T CD4+ CD25high, a także napromieniowanych PBMC do wykorzystania jako komórki prezentujące antygen (APC).

Następnie przygotowuje się monokultury naiwnych lub aktywowanych limfocytów T jako komórek respondujących z BMC P jako APC lub kokultury w tych samych warunkach, ale z dodatkiem treg w stosunku 1 do 10. Ostatnim krokiem jest zebranie komórek i pomiar ich proliferacji za pomocą wbudowywania trytowanej tymidyny. Otrzymane ostatecznie wyniki mogą wykazać różnice w supresji odpowiedzi naiwnych w porównaniu z aktywowanymi in vivo limfocytami T.

Nazywam się Jeff Woodcliff. Limfocyty T regulatorowe nie wykazują unikalnych markerów powierzchniowych. Dlatego, aby wiarygodnie zmierzyć ich funkcję, muszą one zostać wyizolowane przy użyciu technik zapewniających najlepszą separację.

Główną zaletą stosowania sortowania komórek aktywowanego fluorescencją w porównaniu z innymi metodami, takimi jak izolacja maksymalna, jest wysoka czystość uzyskiwanych populacji komórek. Funkcje komórek mogą być następnie wiarygodnie badane w testach supresji in vitro, co zostało tutaj zademonstrowane. Metoda ta pozwala na uzyskanie informacji o funkcji komórek Treg u osób zdrowych oraz u pacjentów z cukrzycą typu pierwszego. Może być ona również zastosowana w przypadku innych chorób autoimmunologicznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów u ludzi, toczeń rumieniowaty układowy, stwardnienie rozsiane i inne. W celu pokrycia kulek aktywowanych TAAL przeciwciałami anty-CD3 przeciwko ludzkim komórkom.

Dodaj jeden mililitr kulek aktywowanych M four 50 toil z oryginalnej fiolki do probówki o pojemności 1,5 mililitra, a następnie umieść probówkę w statywie magnetycznym, aż wszystkie kulki przywrą do ścianki probówki. Następnie usuń bufor do kulek, odpipetowując go, gdy probówka wciąż znajduje się w statywie magnetycznym. Po tym wyjmij probówkę ze statywu magnetycznego i dodaj jeden mililitr buforu jeden.

Wielokrotnie umieszczaj probówkę w statywie magnetycznym. Usuń bufor, gdy probówka znajduje się w statywie magnetycznym. Ponownie resuspenduj kuleczki w 1 ml buforu 1.

Tym razem należy dodać również 40 µL przeciwciała anty-CD3 przeciwko ludzkim komórkom. Inkubować kuleczki z przeciwciałem przy 37 °C przez 15 minut. Następnie dodać 0,1% w/v BSA i kontynuować inkubację przez kolejne 16 godzin.

Następnie dwa razy przemyj kuleczki buforem dwa, inkubując kuleczki w 1 ml buforu dwa przez 5 minut w temperaturze od 2 do 8 °C, a następnie usuwając bufor, gdy probówka znajduje się w statywie magnetycznym. Następnie przemyj kuleczki jeszcze raz w tych samych warunkach sterylnych.

Tym razem, wykorzystując jeden mililitr buforu trzy, przetestuj wydajność powlekania przeciwciałami, dodając zmienną liczbę kulek powlekanych CD3 na komórkę, aby ustalić optymalny stosunek i ALI, dozując 50, 20, 5 000 PBMC na studzienkę w trzech powtórzeniach na płytce 96-dołkowej. Po 72 godzinach hodowli w temperaturze 37 °C dodaj jeden mikrokury tritiated thymidine i kontynuuj inkubację przez kolejne 16 godzin. Zbierz komórki do wielokanałowej płytki do zbioru lub podobnej.

Dodaj ciecz scyntylacyjną i odczytaj liczbę zliczeń na minutę (CPM) dla każdej studzienki. Używając licznika scyntylacyjnego TopCount NX lub podobnego, wyznacz stosunek kulek do komórek; w naszym doświadczeniu najlepsze wyniki uzyskano, gdy CPM konsekwentnie przekraczało 5 000, ale było niższe niż 15 000. Stosunek trzech kulek na jedną komórkę zazwyczaj zapewnia optymalną stymulację zarówno dla komórek responderów, jak i komórek treg u wszystkich badanych osób.

Napełnij 50-mililitrową probówkę stożkową 15 mililitrami fal plus. Następnie wykonaj rozcieńczenie w stosunku jeden do sześciu dla 50 mililitrów warstwy leukocytarnej (buffy coat), dodając 250 mililitrów PBS do probówki z krwią. Powoli nanieś 25 mililitrów rozcieńczonej warstwy leukocytarnej na wierzch fial pack, uważając, aby nie zmieszać warstw.

Wiruj przy 800 ×g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przy wyłączonym hamowaniu ostrożnie zbierz warstwę PBMC, która stanowi białą fazę pośrednią między Ficoll a buforem. W razie potrzeby zeskrob komórki ze ścianek probówki.

Odczekaj kilka minut, a następnie ponownie zbierz je z fazy pośredniej. Przenieś komórki do nowych probówek o pojemności 50 ml i przemyj je, wypełniając probówki buforem PBS, a następnie odwiruj osad. PBM cs.

Powtórz etap płukania dwukrotnie w każdym przypadku. Połącz dwa osady komórkowe w jednej probówce, a ostatecznie wszystkie osady komórkowe w jednej probówce o pojemności 50 ml. Następnie użyj 20 µl zawiesiny komórek, aby ocenić żywotność komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego.

W celu generowania APC przenieś 1 mL żywych pbmc do nowej probówki. Następnie dodaj 4 mL pożywki i napromieniuj komórki dawką 5 000 rad; probówkę zawierającą resztę pbmc uzupełnij buforem PBS. Po odwirowaniu komórek przy 250 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, odlej nadsącz i resuspenduj komórki w 4 mL tej samej mieszaniny.

Następnie do PBMC dodaj 200 µL mikrokulek max anti CD4 i inkubuj mieszaninę komórek i kulek w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Po inkubacji przemyj komórki 40 mL buforu PBS, a następnie odwiruj komórki. Zlej naddatek i resuspenduj komórki w 8 mL odgazowanego buforu PBS w temperaturze pokojowej.

Następnie użyj filtrów do separacji wstępnej, aby odfiltrować zawiesinę komórkową. Następnie podziel PBM CS do dwóch probówek o pojemności 15 ml, dodając do każdej probówki 4 ml P BMCs.

Przymocuj dwie kolumny do separatora minimax i umieść probówki do zbierania pod każdą kolumną. Następnie dodaj 3 mL buforu PBS DGAs do każdej kolumny. Gdy bufor zostanie całkowicie przepuszczony, nanieś całą 4 mL zawiesinę komórek z każdej probówki na kolumny, zanim zawiesina całkowicie wyschnie. Dodaj 3 mL buforu PBS DGAs w temperaturze pokojowej do każdej kolumny i pozwól, aby bufor przepłynął do probówek do zbierania.

Dodawaj bufor, aż wypłukana ciecz stanie się przejrzysta. Pipetuj kolejne pięć mililitrów buforu DGAs na kolumny LS, a następnie wyjmij kolumny LS z separatora minimax. Umieść kolumny w nowych, sterylnych probówkach zbiorczych o pojemności 50 mililitrów.

Pozwól wypłynąć połowie mililitra, a następnie powoli wypchnij pozostałą objętość, która wynosi około czterech mililitrów. Teraz połącz dwie frakcje dodatnie pod kątem CD4. Następnie dodaj do probówki do 50 mililitrów PBS i policz komórki po wirowaniu przy 400 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Resuspender komórki w dwóch mililitrach buforu PBS. Połączyć w jednej probówce przeciwciała przeznaczone do barwienia: anty-CD 14, CD 32, CD 16 oraz opcjonalnie anty-CD 4. Odjąć alikwot mieszaniny do zbarwienia probówki kontrolnej bez fluorochromu.

Przygotować probówkę FMO, przenosząc 5 µL zawiesiny komórkowej z probówki do probówki do cytometrii przepływowej (fax tube) i barwiąc komórki 2 µL wcześniej przygotowanego koktajlu przeciwciał. Następnie dodać niebarwione komórki oraz kulek powlekanych mysią IgG, które zostaną zbarwione pojedynczym fluorochromem, do nowych oddzielnych probówek do cytometrii przepływowej w celu wykorzystania ich jako kontrole kompensacji podczas sortowania komórek. Następnie dodać 50 µL przeciwciała anty-human CD 25 PE do koktajlu, a następnie dodać koktajl do pozostałej zawiesiny komórkowej.

Inkubuj probówki w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Po inkubacji komórek z koktajlem przeciwciał dodaj do nich bufor PBS, a następnie odwiruj je, aby uzyskać osad. Resuspenduj osad w buforze PBS do stężenia 10⁷ komórek/ml.

Użyj probówki FMO do ustawienia progu sortowania komórek T wykazujących ekspresję CD 25. Stosując tę strategię bramkowania, najpierw ustaw bramkę wokół komórek negatywnych pod kątem fitoxydyny, aby wykluczyć komórki pozytywne, które obejmują monocyty, makrofagi i wszystkie pozostałe niebędące limfocytami T komórki CD 4 pozytywne, zgodnie z przedstawioną na tej figurze ilustracją. Na osobnym wykresie wyznacz bramki dla komórek T CD 25 negatywnych i CD 25 low oraz komórek treg CD 25 high, jak pokazano na tej figurze.

Po przepływie i sortowaniu subpopulacji komórek, odwiruj probówki z zebranym materiałem, a następnie przechowuj limfocyty T w lodzie do momentu wysiewania. Oznakuj płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery U zgodnie z tabelą. Do każdego dołka płytki 96-dołkowej wprowadź 50 µL alikwotu kulek pokrytych CD3, obliczonych na stężenie trzech kulek na jedną komórkę respondenta na dołek, w pełnym medium z 10% pulą surowicy AB człowieka, a następnie rozcieńcz wcześniej napromieniowane APC w medium do stężenia 5×10⁵ komórek/mL.

Dodaj 50 µL komórek do płytki 96-dołkowej, a następnie dodaj 2,5 × 10⁴ komórek T CD4+ CD25- lub CD4+ CD25 low do każdego dołka w trzech powtórzeniach. Dodaj Tregs do rzędu B oraz do dołków oznaczonych jako „tylko Tregs” do kokultury w stosunku 1:10, zgodnie z przedstawionym schematem. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 i nasyconą wilgotnością przez 72 godziny. W dalszej kolejności przeprowadź puls komórek 1 µCi tymidyny trytowanej, a następnie kontynuuj inkubację w temperaturze 37 °C przez kolejne 16 godzin, aby tymidyna została wbudowana w ostatnich kilku godzinach kokultury.

Użyj urządzenia filter mate harvester do zebrania komórek z wieloekranowej płytki do zbioru. Następnie przykryj płytkę do zbioru przezroczystą plastikową pokrywką, którą wcześniej wypełniono płynem scyntylacyjnym. Na koniec odczytaj wartość CPM dla każdej studzienki.

Za pomocą licznika scyntylacyjnego w tym systemie można wyizolować subpopulacje limfocytów T o wysokiej czystości, co przedstawiono na poniższej serii wykresów kropkowych. Tutaj, w dolnej bramce, pokazano limfocyty T CD4-dodatnie i CD25-ujemne. Na kolejnej rycinie widoczne są wysokoczyste limfocyty T CD4-dodatnie i CD25-niskie. Czysta populacja CD4-dodatnich limfocytów sortowanych metodą przepływową.

Komórki treg z wysoką ekspresją CD 25 są widoczne w górnej bramce kontrolnej. Hodowle pojedynczych typów komórek APC i treg od zdrowych dawców wykazały niewielką lub żadną proliferację ponad poziom tła, mierzona poprzez wbudowywanie tymidyny, podczas gdy naiwne komórki T CD 25 negatywne oraz aktywowane in vivo komórki T CD 25 niskie wykazały wyraźną proliferację, która jest hamowana, gdy te typy komórek odpowiadających są współhodowane z komórkami treg. Zaobserwowano jednak niewielkie różnice w zdolności komórek treg do supresji naiwnych komórek T CD 25 negatywnych oraz aktywowanych in vivo komórek T CD 25 niskich.

Kontrola nie była istotna. Monokultury jednego typu komórek APC i Treg pochodzące od osób z grupy ryzyka wykazały niewielką lub żadną proliferację powyżej tła, mierzoną włączeniem tymidyny. Natomiast naiwne komórki CD 25 negatywne oraz aktywowane in vivo komórki CD 25 niskie wykazały niższe poziomy proliferacji w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych.

Limfocyty T respondery zostały dodatkowo stłumione przez tregi i kokultury, ponieważ test generuje wiarygodne wyniki. Można dodatkowo wywnioskować, że niskie wartości CPM sugerują potencjalne defekty w transdukcji sygnału, co powinno zostać poddane dalszym badaniom w innym typie analizy. Różnica w zdolności tregów do supresji limfocytów T responderów CD 25 negatywnych w porównaniu do CD 25 niskich u osób z grupy ryzyka była jednak istotna.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak płynnie połączyć wszystkie niezbędne kroki, aby przeprowadzić skuteczny i wiarygodny test funkcjonalny obecności Tregs u osób zdrowych oraz u osób z upośledzonym układem odpornościowym, na przykład u osób z cukrzycą typu pierwszego.