Analizy biofizyczne służące do badania właściwości mechanicznych interfazy jądra komórkowego: aplikacja odkształcenia podłoża i manipulacja mikroiłką

Ogólnym celem następujących eksperymentów jest pomiar właściwości mechanicznych interfejsu jądra komórkowego oraz jego fizycznego połączenia z otaczającym go cytoszkieletem. Osiąga się to poprzez przyłożenie odkształcenia mechanicznego do komórek wysianych na przezroczystej membranie silikonowej i obrazowanie indukowanych deformacji jądra. Zwiększone deformacje jądra odpowiadają zmniejszonej sztywności jądra, ponieważ zmiany w sprzężeniu jądro-cytoszkielet również mogą wpływać na indukowane deformacje jądrowe.

Wewnątrzkomórkową transmisję sił między cytoszkieletem a jądrem badano bezpośrednio poprzez przyłożenie zlokalizowanego odkształcenia do cytoszkieletu. Następnie obrazowano przemieszczenie fluorescencyjnie znakowanych struktur jądrowych NU oraz cytoszkieletowych. Otrzymane wyniki obrazują sztywność jąder komórkowych w stosunku do otaczającego je cytoszkieletu.

Na podstawie eksperymentów z naprężeniem podłoża, test manipulacji mikroigłami wykazuje, że zaburzenie sprzężenia nukleo-cytoszkieletowego powoduje wady w wewnątrzkomórkowym przekazywaniu sił. Główną zaletą tych technik w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak aspiracja mikropipetą izolowanych jąder, jest to, że umożliwiają one pomiary mechaniki jądra w nienaruszonych żywych komórkach, bez zakłócania normalnej architektury komórkowej. Metody te mogą dostarczyć wiedzy na temat tego, w jaki sposób zmiany w składzie otoczki jądrowej mogą wpływać na właściwości mechaniczne jądra.

Można je również zastosować do badania roli mechaniki jądra komórkowego w kontekście takich schorzeń jak neuropatie LA lub nowotwory. Każda szalka do rozciągania składa się z wykonanej na zamówienie plastikowej szalki bez dna o średnicy trzech cali oraz plastikowego pierścienia O-ring do utrzymania membrany silikonowej, która służy jako podłoże do hodowli komórek. Aby przygotować szalkę do rozciągania, należy przymocować kawałek membrany silikonowej o wymiarach czterech na cztery cale pomiędzy pierścieniem a szalką, ostrożnie odciąć nadmiar membrany, wypłukać szalkę wodą dejonizowaną, a następnie poddać szalkę autoklawowaniu przed pokryciem membrany silikonowej cząsteczkami macierzy zewnątrzkomórkowej; na zewnętrznej stronie membrany, na środku od dołu, należy zaznaczyć punkt odniesienia.

Punkt orientacyjny ten pomoże zidentyfikować te same komórki podczas eksperymentów z odkształceniami w celu zastosowania odkształcenia jednowymiarowego. Dwie równoległe paski taśmy klejącej nakłada się wokół punktu odniesienia, aby ograniczyć formowanie się membrany w jednym wymiarze. Aby zapewnić optymalną adhezję komórek, należy pokryć membrany silikonowe fibronektyną w stężeniu 3 µg/mL lubtinnymi odpowiednimi białkami macierzy pozakomórkowej.

Przykryj szalkę z sitem odwróconą szalką polistyrenową o średnicy 10 centymetrów i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przepłucz membranę raz roztworem PBS, aby usunąć nadmiar białka. Napełnij szalkę 10 mililitrami pożywki wzrostowej i odstaw.

Po przygotowaniu płytki z powłoką z membrany silikonowej, komórki traktuje się trypsyną 0,05%, a następnie wysiewa komórki adherentne na płytkę w medium hodowlanym. Procedura ta została zaprezentowana na przykładzie komórek embrionalnych myszy.

Fibroblasty lub mezencym inkubuje się przez 24 do 48 godzin w standardowych warunkach hodowli. Mikroskop odwrócony, przystosowany do eksperymentów z odkształceniem podłoża, wyposażony jest w urządzenie do rozciągania, składające się z płyty podstawowej dopasowanej do stolika mikroskopu. Płyta ta utrzymuje centralną cylindryczną platformę, która służy do wywierania naprężeń na centralną część membrany silikonowej.

Urządzenie posiada również ruchomą płytkę, która utrzymuje naczynie do rozciągania i może przesuwać się w górę oraz w dół na czterech prowadnikach, a także ciężarek o masie pięciu funtów do przykładania obciążenia. Aby zwizualizować jądra komórkowe, inkubuj komórki w naczyniu do rozciągania z jedną mikrogram na mililitr barwnika Hoechst przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Po inkubacji odessać medium i zastąpić je 15 ml wolnego od czerwieni fenolowej medium wzrostowego z 25 mM HEPES.

Następnie wkręć naczynie do uchwytu i ostrożnie nałóż smar na obwód dolnej części membrany silikonowej, aby zapewnić poślizg membrany wzdłuż centralnej platyny. Upewnij się, że centralna sekcja membrany pozostaje czysta. Umieść płytę podstawową na stole mikroskopu i ostrożnie zamontuj uchwyt naczynia na płycie podstawowej.

Należy upewnić się, że w początkowej pozycji spoczynkowej membrana silikonowa naczynia do rozciągania luźno spoczywa na centralnej platformie. Następnie należy skupić ostrość na spodzie membrany silikonowej i odnaleźć centralny czarny punkt referencyjny. Punkt ten będzie służył jako punkt wyjścia dla wszystkich akwizycji obrazów i pomoże w lokalizowaniu tych samych komórek w trakcie oraz po rozciąganiu.

Na tym obrazie centralna kropka wypełnia całe pole widzenia. Zaczynając od krawędzi kropki, należy dostosować ostrość, aby zwizualizować komórki oraz górną powierzchnię membrany silikonowej. Należy zlokalizować dobrze rozprzestrzenione komórki z centralnie położonymi jądrami.

Należy uzyskać obraz kontrastowy fazowy, skupiając ostrość na obrysie komórki oraz membranie silikonowej. Następnie należy wykonać obraz fluorescencyjny barwienia haczyka jądrowego (nuclear hook stain), skupiając ostrość na płaszczyźnie centralnej jądra. Po wykonaniu obrazów od pięciu do 15 komórek należy powrócić do centralnego punktu.

Powoli przyłóż obciążenie do naczynia rozciągającego, aby zapewnić jednorodną aplikację odkształcenia w centrum naczynia. Maksymalne przyłożone odkształcenie podłoża jest ograniczone przez nylonowe dystansowce umieszczone na pionowych pinach centrujących. Po zastosowaniu odkształcenia skup się na spodzie membrany silikonowej i ponownie zlokalizuj punkt referencyjny, zaczynając od kropki.

Przenieś te same komórki i ponownie wykonaj obraz w kontraście fazowym oraz obraz fluorescencyjny każdego jądra komórkowego pod pełnym naprężeniem, starając się jak najdokładniej dopasować płaszczyznę ogniskowania do obrazów początkowych. Proces ten nie powinien przekraczać 10 minut, aby uniknąć aktywnego przebudowywania i adaptacji komórki do obcego podłoża. Po wykonaniu wszystkich odpowiadających sobie obrazów przenieś stolik mikroskopu z powrotem do punktu wyjściowego.

Ostrożnie zdejmij obciążnik z płytki uchwytu naczynia i w razie potrzeby poczekaj, aż membrana silikonowa powróci do swojego stanu pierwotnego. Delikatnie wypchnij naczynie do góry, aż znajdzie się w pozycji początkowej. Następnie ustaw kontrast fazowy i fluorescencję.

Analizowane są obrazy komórek po rozciąganiu, zgodnie z opisem dla obrazów w trakcie rozciągania, a także obrazy komórek i fluorescencyjnie znakowanych jąder przed, w trakcie i po zastosowaniu rozciągania, aby obliczyć znormalizowane odkształcenie jądra. W niniejszej demonstracji do analizy wykorzystano specjalnie napisany skrypt w programie MATLAB, jednak dostępne są różne alternatywne opcje umożliwiające ręczne obliczenie przyłożonego odkształcenia podłoża poprzez dopasowanie pozycji od trzech do sześciu punktów kontrolnych znajdujących się na błonie pomiędzy odpowiadającymi sobie obrazami sprzed rozciągania i po pełnym rozciąganiu. Program MATLAB oblicza następnie przyłożone odkształcenie błony, porównując pozycje dopasowanych punktów kontrolnych między obrazami sprzed rozciągania i obrazami pełnego rozciągania.

Porównuje się również położenia w celu określenia odkształcenia szczątkowego między obrazami sprzed i po przyłożeniu naprężenia. Punkty kontrolne służą jednocześnie do rejestracji par obrazów, co pomaga w wykryciu uszkodzonych lub odrywających się komórek. Następnie, za pomocą oddzielnego programu MATLAB, który oblicza odkształcenie jądra dla każdego poszczególnego jądra komórkowego, dokonuje się ręcznego wyboru jąder.

Osiąga się to poprzez dopasowanie rozmiaru jądra między odpowiadającymi sobie obrazami fluorescencyjnymi sprzed i po przyłożeniu odkształcenia lub poprzez dopasowanie markerów wewnątrzjądrowych, aby uwzględnić niewielkie różnice w przyłożonym odkształceniu błony pomiędzy różnymi eksperymentami. Wyniki są przedstawione jako znormalizowane odkształcenie jądra. Definiuje się je jako stosunek wywołanego odkształcenia jądra do przyłożonego odkształcenia błony, obliczony dla każdego jądra.

Skrypty MATLAB są dostępne w laboratorium lambing na żądanie. W ramach ostatniego kroku każde jądro komórkowe jest weryfikowane, a pomiary z komórek, które oddzieliły się lub uległy uszkodzeniu podczas przykładania naprężenia, są wykluczane. MEF rozprzestrzenione na dwóch oddzielnych obszarach membrany silikonowej były obrazowane za pomocą mikroskopii fazokontrastowej i fluorescencyjnej przed, w trakcie i po zastosowaniu 20% jednowymiarowego naprężenia osiowego; przedstawiony tutaj przykład obrazuje udany eksperyment z prawidłowymi jądrami komórkowymi z komórek, które przetrwały zastosowanie naprężenia bez żadnych uszkodzeń lub oddzielenia.

W przeciwieństwie do nich, komórki przedstawione tutaj uległy obkurczeniu lub częściowemu odklejeniu podczas przykładania odkształcenia i zostały wykluczone z analizy. Komórka po lewej stronie wykazuje oznaki uszkodzenia cytoszkieletu i kolapsu jądra, natomiast komórka po prawej stronie częściowo się odkleja i obkurcza podczas przykładania odkształcenia. Może to być oznaką nadmiernego odkształcenia.

Przedstawiono tutaj analizę znormalizowanego naprężenia jądrowego w panelu różnych linii komórkowych z myszy z niedoborem laminy AC, w których komórki ektopowo wykazują ekspresję pustego wektora lub laminy A typu dzikiego, w porównaniu z myszami z miotu typu dzikiego. Utrata ekspresji białek otoczki jądrowej laminy AC skutkuje zwiększonym znormalizowanym naprężeniem jądrowym. Świadczy to o zmniejszonej sztywności jądra, która może zostać częściowo lub całkowicie przywrócona poprzez ponowne wprowadzenie laminy A typu dzikiego. Aby przygotować się do eksperymentu z manipulacją za pomocą mikroiły, inkubuj szalkę do hodowli komórkowej z dna szklanego o średnicy 35 mm z niską koncentracją fibronektyny przez dwie godziny w temperaturze 37 °C; po inkubacji przemyj szalkę dwukrotnie roztworem HBSS i dodaj do niej 2 ml pożywki wzrostowej.

Następnie zarodkowe fibroblasty mysie poddaje się trypsynizacji przy użyciu 0,05% trypsyny i wysiewa w pożywce wzrostowej na szalki z szklanym dnem pokryte fibronektyną w dwóch mililitrach pożywki wzrostowej. Aby uzyskać pojedyncze, przylegające, niekonfluentne komórki, należy umieścić je z powrotem w inkubatorze na noc. W celu zabarwienia komórek do pożywki wzrostowej dodaje się barwnik mitochondrialny MitoTracker oraz barwnik jądrowy Hoechst. Pożywkę tę dodaje się do komórek, a następnie przeprowadza inkubację.

Następnie należy wypłukać komórki, inkubując je w soli fizjologicznej Hanksa przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie do komórek dodaje się pożywkę wzrostową bez czerwieni fenolowej z 25 mM HEPES w celu przeprowadzenia obrazowania.

W celu przeprowadzenia eksperymentu z mikroiigłą, umieść wcześniej wyciągniętą mikroigłę w mikromanipulatorze sprzężonym z odwróconym mikroskopem wyposażonym w cyfrową kamerę CCD. Ustaw ostrość i pozycjonuj mikroigłę w pobliżu pojedynczej komórki. Pobierz jeden obraz pojedynczej komórki przed wprowadzeniem mikroigły do cytoszkieletu.

W kontraście fazowym wykonaj jedno zdjęcie fluorescencyjne barwienia hooks 3 3, 3 4 2 oraz jedno zdjęcie fluorescencyjne barwienia mitochondriów przy użyciu obiektywu 60 x w mikroskopie odwróconym. Używając mikromanipulatora, ostrożnie wprowadź mikroiġłę do cytoplazmy komórki w ustalonej odległości od peryferii jądra, a następnie wykonaj jedno zdjęcie w kontraście fazowym, jedno zdjęcie fluorescencyjne barwienia hooks 3 3, 3 4, 2 oraz jedno zdjęcie fluorescencyjne barwienia mitochondriów. Przesuwaj mikroiġłę na określoną odległość w stronę peryferii komórki z prędkością 1 µm/s, korzystając z komputerowo sterowanego mikromanipulatora, przy jednoczesnym automatycznym pozyskiwaniu obrazów co 10 s.

Podczas przesuwania mikroigły na określoną odległość w kierunku obwodu komórki, mikromanipulator powinien być sterowany za pomocą komputera, aby zapewnić powtarzalną mikromanipulację. Procedura kończy się wykonaniem obrazowania po usunięciu mikroigły; obrazy fluorescencyjnie znakowanych struktur jądra oraz cytoszkieletu, wykonane przed, w trakcie i po manipulacji mikroigłą, są analizowane w celu obliczenia przemieszczenia niewielkich obszarów wewnątrzkomórkowych. W niniejszej demonstracji do analizy wykorzystano skrypt napisany w programie MATLAB, jednak dostępne są również inne rozwiązania.

Skrypt MATLAB służący do pomiaru przesunięcia wywołanego przez mikroiğłę jest dostępny w laboratorium lambing na zapytanie. Program MATLAB wykorzystuje algorytm znormalizowanej korelacji wzajemnej do obliczenia przesunięcia między pierwotnym położeniem cech znakowanych fluorescencyjnie a ich nowo zidentyfikowaną pozycją. Przesunięcia są następnie wyświetlane w formie map wektorowych i zapisywane jako wartości liczbowe.

Kolejnym krokiem jest wykorzystanie otrzymanych map wektorów przemieszczeń do wyznaczenia średnich przemieszczeń wewnątrz cytoszkieletu lub jądra komórkowego przy użyciu programu Matlab. Najpierw należy wybrać trzy lub więcej punktów w obrębie cytoszkieletu w miejscu przykładania odkształcenia. Na mapie wektorów przemieszczeń należy obliczyć średnią wartość liczbową, aby określić stopień odkształcenia cytoszkieletu w pobliżu miejsca aplikacji, który został wygenerowany podczas aplikacji mikroiły.

Następnie należy wybrać trzy lub więcej punktów w obrębie jądra w pobliżu miejsca przykładania odkształcenia i obliczyć wartość średnią. Wartość ta reprezentuje stopień odkształcenia jądra w pobliżu miejsca aplikacji mikroiły. Stosując tę samą metodę, należy określić odkształcenie jądra oraz cytoszkieletu z dala od miejsca przykładania odkształcenia, wybierając punkty w odpowiednio wskazanych obszarach.

Przeprowadzono test manipulacji mikroiłami w celu pomiaru wewnątrzkomórkowej transmisji sił. Przedstawiono tutaj obrazy w kontraście fazowym oraz obrazy fluorescencyjne fibroblasta znakowanego niebieskim barwnikiem jądrowym oraz zielonym barwnikiem mitochondriów MIT tracker. Mikroiłę wprowadzono do cytoszkieletu w określonej odległości od jądra, a następnie przemieszczono w kierunku obwodu komórki.

Przemieszczenia mitochondriów śledzono przed, w trakcie i po obciążeniu cytoszkieletu, a następnie przedstawiono je w formie wektorów. Każdy wektor reprezentuje przemieszczenie obliczone jako przesunięcie między położeniem pierwotnym a nowo zidentyfikowaną pozycją. Z analizy wykluczono obszary o niskiej intensywności obrazu lub niewystarczającej teksturze.

Następnie ilościowo określono przemieszczenie cytoszkieletu i jądra w wybranych obszarach, w coraz większej odległości od miejsca przyłożenia odkształcenia, zarówno dla fibroblastów kontrolnych, jak i fibroblastów. W komórkach z nienaruszonym sprzężeniem nukleo-cytoszkieletowym siły są przenoszone przez całą komórkę, co prowadzi do indukowanej deformacji jądra i cytoszkieletu, która powoli zanika w miarę oddalania się od miejsca przyłożenia odkształcenia. W przeciwieństwie do nich, komórki z zaburzonym sprzężeniem nukleo-cytoszkieletowym wykazują lokalne przemieszczenie w pobliżu miejsca przyłożenia siły i jedynie niewielką indukowaną deformację w większej odległości.

Porównywalne przyłożenie odkształcenia cytoszkieletu w miejscu wprowadzenia mikroiły obserwuje się zarówno w przypadku fibroblastów kontrolnych, jak i fibroblastów z zaburzonym sprzężeniem nukleo-cytoszkieletowym. Jednakże indukowane przemieszczenie jądra i cytoszkieletu w innych obszarach było znacznie mniejsze w fibroblastach z zaburzonym sprzężeniem nukleo-cytoszkieletowym niż w komórkach kontrolnych. Zatem spadek przemieszczenia cytoszkieletu i jądra poza miejsce przyłożenia odkształcenia wskazuje, że wymuszona transmisja między cytoszkieletem a jądrem została zaburzona.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś uzyskać dobrą wiedzę na temat pomiaru mechaniki jądrowej oraz wewnątrzkomórkowego przekazywania sił między jądrem a cytoszkieletem. Techniki te można wykorzystać do badania wpływu mutacji w białkach otoczki jądrowej lub zmian w składzie otoczki jądrowej występujących podczas rozwoju lub w nowotworach.