Badanie wrażliwości kompleksu Mycobacterium tuberculosis na leki pierwszego i drugiego rzutu metodą rozcieńczeń w bulionie z wykorzystaniem płytek mikrotitracyjnych

Dostępnych jest stosunkowo niewiele leków do leczenia mycobacterium tuberculosis, dlatego oporność na jakikolwiek preparat jest kwestią niepokojącą. Niniejszy artykuł wideo opisuje procedurę jednoczesnego badania oporności M tuberculosis na 12 różnych leków przeciwdrobnoustrojowych. Zatem zdolność do szybkiego wykrywania oporności M tuberculosis na leki przeciwdrobnoustrojowe jest bardzo istotna w wysiłkach na rzecz ograniczenia wzrostu liczby szczepów opornych, co służy tutaj do testowania wrażliwości na antybiotyki.

Próbki M tuberculosis są najpierw hodowane na podłożach stałych lub w pożywkach płynnych w celu uzyskania zawiesiny bakteryjnej. Inokulum jest przygotowywane i nanoszone na płytkę mikrotitracyjną zawierającą różne stężenia 12 leków, w tym leków pierwszego i drugiego rzutu. Po inkubacji stopień wzrostu w każdej studzience jest określany ręcznie przy użyciu lustrzanego pudełka lub za pomocą półautomatycznego czytnika płytek.

Otrzymane dane wskazują minimalne stężenie hamujące dla każdego z badanych leków i pokazują, na które antybiotyki oporny jest badany szczep prątków gruźlicy. Wyniki te pomagają w wyborze odpowiedniego leku do leczenia gruźlicy. Dzień dobry, nazywam się Nancy Ek i jestem dyrektorem Laboratorium Mykobakteriologii w Mayo Clinic w Rochester w stanie Minnesota.

W dzisiejszym materiale przedstawimy metodę przeprowadzania testów wrażliwości *Mycobacterium tuberculosis* na antybiotyki. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak makrorozcieńczanie w bulionie, jest możliwość wyznaczenia MIC dla każdego leku oraz jednoczesnego przetestowania 12 antybiotyków. Procedurę zaprezentuje Kurt Jude, specjalista ds. jakości w moim laboratorium, pracujący przy stole laboratoryjnym.

W celu przygotowania do tej procedury należy oznakować płytkę z agarem krwi, trzy płytki Middlebrooks 7H10, probówkę z kuleczkami szklanymi zawierającą roztwór soli fizjologicznej z Tweenem oraz płytkę mikrotitracyjną, wpisując imię i nazwisko pacjenta oraz numer identyfikacyjny próbki. Dodatkowo, płytkę z agarem krwi oraz płytki 7H10 należy oznakować jako kontrolę czystości. Jedną z płytek 7H10 należy oznaczyć jako przeliczenie kolonii 1:1, a drugą jako przeliczenie kolonii 1:50.

Następnie umieść tacę w śluzie transferowej. W kolejnym kroku przygotuj się do pracy w laboratorium poziomu trzeciego bezpieczeństwa biologicznego BSL-3, zakładając fartuch z pełnym przodem, osłonę głowy, rękawiczki, ochraniacze na obuwie oraz respirator. W tym przypadku zastosowano respirator PAPR.

Następnie wyjmij tacę z okna podawczego. W następnym kroku, w laboratorium poziomu BSL 3, zdezynfekuj powierzchnię komory bezpieczeństwa biologicznego. Następnie umieść wewnątrz wyciągu ręcznik papierowy nasączony środkiem dezynfekującym, w odległości około six inches od panelu wentylacyjnego, obok ręcznika papierowego.

Przygotuj pętle do szczepienia, pipety i końcówki, odpowiedni pojemnik na odpady, nephi, TER oraz wirówkę typu vortex. Po przygotowaniu dygestorium umieść organizm na ręczniku papierowym wraz ze statywem zawierającym standard McFarland 0,5, bulion A seven H nine z OADC oraz probówkę z koralikiem w soli fizjologicznej. Przygotowanie to jest wykonywane z podłoża stałego.

Przygotować inokulum z hodowli na podłożu stałym z próbki pacjenta. Za pomocą sterylnej pętlki zebrać kolonie i przenieść je do probówki z kuleczkami szklanymi zawierającej roztwór soli fizjologicznej z Tweenem. Mieszać zawiesinę w wstrząsarzu typu vortex od 30 do 60 sekund.

Przeprowadź kontrolę wizualną próbki, porównując ją ze standardem McFarlanda. Ilość przeniesionego materiału powinna być równa lub większa niż w przypadku standardu. Jeśli nie jest tak w rzeczywistości, dodaj więcej próbki bakteryjnej i ponownie wymieszaj w wirówce vortex.

Po dopasowaniu do standardu McFarlanda należy odstawić inokulum na 15 minut, aby większe skupiska bakterii mogły opaść na dno. Następnie należy użyć nefelometru do zmierzenia gęstości zawiesiny bakterii do zera. Nefelometr.

Najpierw umieść w nefelometrze probówkę z pustym koralikiem solnym. Naciśnij przycisk kalibracji, aby wyzerować instrument, a następnie umieść w nefelometrze wzorzec McFarland 0.5 i ponownie naciśnij przycisk kalibracji. Po skalibrowaniu instrumentu wyjmij wzorzec McFarland i włóż inokulum.

Odczyt inokulum powinien być równy odczytowi standardu McFarlanda. Jeśli odczyt jest zbyt niski, należy wyjąć probówkę i przenieść z płytki więcej bakterii. Następnie próbkę należy wymieszać w wortexie i ponownie odczytać jej wartość.

Jeśli odczyt jest zbyt wysoki, należy dodać do probówki roztwór soli fizjologicznej z Tweenem i wymieszać w wortexie. Następnie ponownie odczytać próbkę. Kontynuować regulację inokulum w razie potrzeby, aż stężenie bakterii będzie zgodne ze standardem McFarlanda.

Następnie, używając pipety 200 µl oraz długiej końcówki z filtrem zapobiegającym aerozolom, pobierz 100 µl inokulum z górnej jednej trzeciej probówki. Aby uniknąć grudek osadzających się na dnie bulionu Middlebrook 7H9, powoli wymieszaj inokulowany bulion wirówką przez 20 sekund przed wysianiem inokulum na płytkę. Rozpocznij od wyjęcia płytki mikrotitracyjnej z opakowania producenta. Jeśli osuszacz jest niebieski lub opakowanie z folii jest uszkodzone, nie należy go używać.

Płytka zawiera już 12 środków przeciwdrobnoustrojowych do przetestowania w każdej studni, w tym leki najskuteczniejsze lub pierwszego rzutu oraz leki drugiego rzutu. Ostrożnie przelej inokulum w bulionie H nine do probówki, dbając o to, aby nie generować aerozoli. Następnie umieść płytkę do miareczkowania mikrobiologicznego etykietą skierowaną na zewnątrz, jak pokazano tutaj, i za pomocą pipety 12-kanałowej dodaj 100 µL inokulum do każdej studni.

Następnie należy przygotować płytki do zliczania kolonii. Najpierw przygotuj płytkę bez rozcieńczenia, przenosząc za pomocą pętli o objętości 1 µL próbkę z dołka kontroli pozytywnej na płytkę 7H10 oznaczoną jako 1:1. Następnie użyj pętli, aby wykonać posiew na płytce, jak pokazano tutaj.

Następnie, aby przygotować rozcieńczenie 1:50, przenieś pętlę o objętości 1 µL z dołka kontroli pozytywnej i zamieszaj nią w probówce zawierającej 50 µL wody. Nanieś 1 µL tego rozcieńczenia na płytkę oznaczoną jako 1:50. Zaszczep płytki do kontroli czystości, pipetując 50 µL inokulum z pożywki na odpowiednio oznaczone agar krwi oraz płytki 7H10, a następnie wykonaj posiew w celu izolacji kolonii.

Następnie na zaszczepionym podłożu TRTH ułóż drugą warstwę podłoża TRTH i ostrożnie umieść je w pojemniku na odpady. Na płytkę mikrotitracyjną nałóż uszczelkę adhezyjną. Następnie, korzystając z białej podkładki, mocno dociśnij każdą studzienkę, aby zapewnić odpowiednie uszczelnienie, dbając o to, by nie powstały żadne zagięcia.

Zdezynfekuj płytkę mikrotitrową, przecierając ją ręcznikiem papierowym nasączonym środkiem dezynfekcyjnym o działaniu przeciwprątkowym. Następnie umieść płytkę mikrotitrową w plastikowej torbie i zamknij ją za pomocą zgrzewarki termicznej. Na koniec zdezynfekuj wszystkie materiały, w tym pipety, wirówkę typu vortex, płytki i probówki, przecierając je środkiem dezynfekcyjnym o działaniu przeciwprątkowym.

W tym przypadku spray do dezynfekcji jest stosowany po upływie czasu wystarczającego do zapewnienia pełnej sterylizacji. W przypadku tego preparatu czas oczekiwania wynosi 15 minut. Płytki są zaklejone taśmą klejącą, umieszczone w plastikowych workach, a szczelnie zamknięte materiały są usuwane z komory bezpiecznej biologicznie i przenoszone do śluzy.

W tym momencie czerwony worek na odpady zostaje zamknięty i uszczelniony za pomocą wiązadła, a następnie zdejmuje się fartuch, ochraniacze na buty oraz rękawice. Po przejściu do pomieszczenia śluzy i umyciu rąk, należy zdjąć respirator, a po ponownym umyciu rąk zdezynfekować go i schować; następnie zakłada się nowy fartuch i opuszcza strefę BSL 3. Następnie pojemnik z odpadami poddaje się autoklawowaniu.

Następnie inkubuj płytkę mikrotitracyjną oraz siedem płytek H 10 i blood auger w pozycji poziomej w inkubatorze w temperaturze 35 do 37 °C z 5 do 10% CO2 w laboratorium BSL 2. Jest to dopuszczalne, ponieważ płytka jest szczelnie zamknięta i znajduje się w plastikowym worku. Czas generacji mycobacterium tuberculosis wynosi około 12 do 24 godzin, zatem minie co najmniej tydzień, zanim wzrost będzie widoczny w postaci komórka pelletu na dnie dołka kontrolnego. W 10. dniu wykonaj manualny odczyt MIR, umieszczając zamkniętą płytkę mikrotitracyjną AST na platformie urządzenia MIR box.

Użyj lampki biurkowej, aby ułatwić wizualizację wzrostu, i dostosuj jej ustawienie w celu uzyskania najlepszego kontrastu. Sprawdź studzienki kontrolne wzrostu, w tym przypadku H 11 i H 12, patrząc w lustro. Jeśli występuje wzrost, studzienka będzie wyglądać na mętną lub będzie w niej widoczny osad, tak jak pokazano tutaj.

Jeśli nie występuje wzrost, jak pokazano w tym przykładzie, studzienka będzie wydawać się przejrzysta. W takim przypadku należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze i kontynuować inkubację do 21 dni. Dla każdego wariantu należy porównać wzrost z kontrolą.

W takim razie, dla każdego zapisu leku, pierwszym rozcieńczeniem, w którym nie stwierdzono wzrostu, jest minimalne stężenie hamujące lub MIC dla danego leku. Aby zbadać wyniki przy użyciu zautomatyzowanego czytnika płytek, takiego jak Vision, należy rozpocząć od uruchomienia oprogramowania MycoTB AST plate i zalogowania się, a następnie umieścić zamkniętą płytkę kodem kreskowym skierowanym na zewnątrz. Jak pokazano tutaj, wzrost objawia się mętnością lub osadem komórek na dnie dołka na ekranie komputera.

W pierwszej kolejności należy sprawdzić kontrole wzrostu, analogicznie jak poprzednio. Jeśli w kontroli nie stwierdzono wzrostu, należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na okres do 21 dni.

Jeśli wynik jest dodatni, zarejestruj go, dotykając na ekranie pierwszej studni dla każdego leku, w której nie stwierdzono wzrostu. W niektórych przypadkach bakterie, osad lub leki wytrącają się na dnie studni. Zjawisko to, znane jako trailing, objawia się obecnością kilku studni z osadem o tej samej wielkości i nie jest uznawane za faktyczny wzrost dodatni.

Następnie siedem płytek z agar H 10 oraz agar z krwią poddaje się analizie w celu określenia stężeń bakterii i oceny czystości. Na płytce z agarem z krwią po 48 godzinach nie powinien być widoczny wzrost. Wzrost na płytce z agarem z krwią wskazuje na zanieczyszczenie szybko rosnącymi bakteriami.

W przypadku stwierdzenia wzrostu należy powtórzyć test w mikropłytce. Na płytce do badania czystości H 10 powinien wystąpić wzrost jednego organizmu. Szczepy EM tuberculosis powinny mieć kolor beżowy, być pomarszczone i szorstkie. W przypadku zanieczyszczenia test w mikropłytce należy powtórzyć, używając czystej kultury.

Aby ocenić stężenie bakterii, należy policzyć kolonie na płytce H 10. Następnie, korzystając z tabeli w dołączonym dokumencie pisemnym, obliczyć liczbę kolonii. Mycobacterium tuberculosis wyhodowano z próbki pobranej od pacjenta, a oporność na antybiotyki oceniono zgodnie z opisem w tym filmie; na pokazanej tutaj płytce znajduje się 12 różnych leków w rosnących stężeniach, przy czym najwyższe stężenia znajdują się u góry, a najniższe na dole.

Minimalne stężenie hamujące (MIC) leku określono jako najniższe stężenie leku, przy którym nie stwierdzono wzrostu; zostało ono zakreżone na przedstawionym obrazie zgodnie ze znormalizowanymi wartościami granicznymi ustalonymi przez Clinical and Laboratory Standards Institute. Przedstawione dane sugerują, że ten szczep TB będzie oporny na Isid i Rifampinę. In vitro wysokie wartości MIC zaobserwowane dla kilku innych leków, w tym oin, moksiflocyny, streptomycyny i rifabutyny, wskazują na oporność szczepu gruźlicy EM na te środki.

Wyniki MIC powinny zostać wykorzystane przez specjalistę chorób zakaźnych z doświadczeniem w leczeniu gruźlicy w celu opracowania indywidualnego planu terapii. Po opanowaniu techniki przygotowanie jednego izolatu zajmuje około 40 minut. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że jest to patogen układu oddechowego i nie wolno generować aerozoli. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania testu wrażliwości Mycobacterium tuberculosis na środki przeciwdrobnoustrojowe z wykorzystaniem metody mikrorozcieńczeń w bulionie. Należy pamiętać, że praca z Mycobacterium tuberculosis może być niezwykle niebezpieczna, dlatego zawsze należy przestrzegać wymaganych środków ostrożności, takich jak ochrona dróg oddechowych.