Optyczne mapowanie wysokiej rozdzielczości wsierdzia i osierdzia w owczym modelu migotania przedsionków wywołanego rozciąganiem

Niniejszy protokół wykorzystuje mapowanie optyczne o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej w celu zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw migotania przedsionków indukowanego rozciąganiem. Osiąga się to poprzez wyeksplantowanie serca owczego i podłączenie go przez aortę do systemu perfuzji LAN endorf z krążącym natlenionym roztworem Tyro. Wykorzystuje się nakłucie transseptalne przedsionka, aby zamknąć wszystkie ujścia żył z wyjątkiem żyły głównej dolnej, która służy do kontroli ciśnienia wewnątrzprzedsionkowego.

Następnie, przy ciągłym rozciąganiu przedsionka, indukuje się utrwalony migotanie przedsionków za pomocą stymulacji seryjnej (burst pacing) z elektrody umieszczonej na szczycie uszka lewego przedsionka. Ostatnim krokiem jest optyczne i elektryczne mapowanie powierzchni epikardialnej i endokardialnej uszka lewego przedsionka oraz tylnej ściany lewego przedsionka przy użyciu kamer CCD z oświetleniem laserowym oraz elektrod bipolarnych. Wyniki wykazują gradienty częstotliwości dominującej od tylnej ściany lewego przedsionka w kierunku uszka lewego przedsionka oraz prawego przedsionka.

Dodatkowo zidentyfikowano sporadycznie występujące, długotrwałe rotory z centrami rotacji w najwyższym zakresie częstotliwości. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak konwencjonalne mapowanie elektryczne tradycyjnie stosowane w badaniach elektrofizjologicznych u ludzi, jest to, że optyczne mapowanie epikardialne i endokardialne lewego przedsionka zapewnia wysoką rozdzielczość czasową i przestrzenną na dużym obszarze, co pozwala na śledzenie fal migotania przedsionków w różnych regionach, w tym w obszarach o wysokiej częstotliwości rotorów, które podtrzymują migotanie przedsionków. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie elektrofizjologii serca i złożonych arytmii serca, takie jak to, jakie są szczególne czasowe wzorce aktywacji leżące u podstaw podtrzymania najczęstszej utrwalonej arytmii w praktyce klinicznej.

Implikacje zastosowania tej techniki otwierają możliwości terapeutyczne w zakresie zapobiegania lub przerywania migotania przedsionków, w oparciu o lepsze zrozumienie jego mechanizmów. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką będą miały trudności z płynnym wykonaniem wszystkich etapów w rozsądnym czasie. Należy zauważyć, że czas na izolację jest ograniczony i wynosi około czterech godzin.

Serce przygotowuje się w warunkach odpowiednich do mapowania optycznego arytmii. Wymaga to określonych umiejętności chirurgicznych w celu prawidłowego przygotowania modelu rozciągania przedsionków, a także umiejętności technicznych niezbędnych do konfiguracji systemu mapowania elektrycznego i optycznego. Po podaniu heparyny oraz znieczuleniu owcy o masie od 35 do 40 kg propofolem i pentobarbitalem, należy przeprowadzić torakotomię w celu pobrania serca.

Podłącz wypreparowane serce do systemu perfuzji LANG z krążącym natlenionym roztworem Tyro o pH 7,4, ustaw stałą prędkość przepływu w zakresie od 240 do 270 ml/min oraz utrzymuj temperaturę między 35,5 a 37,5 °C. Rozpocznij od wyrównania ciśnienia wewnątrzjamowego w obu przedsionkach perfundowanego serca. Wykonując nakłucie transseptalne przedsionka, zakanuluj żyłę główną dolną za pomocą rurki odpływowej.

Następnie należy dostosować ciśnienie wewnątrzprzedsionkowe poprzez zmianę wysokości otwartej kanuli odpływowej nad przedsionkami. Teraz należy zamknąć wszystkie ujścia żył, w tym zatokę wieńcową, żyłę główną górną oraz cztery żyły płucne. Podczas zamykania żył płucnych, w każdej z nich należy umieścić cewniki w celu rejestracji sygnałów bipolarnych z dwóch elektrod dystalnych za pomocą wzmacniacza różnicowego.

Następnie, aby ograniczyć ruchy tkanki wywołane kurczliwością miocytów serca, należy dodać do perfuzji 10 µM statyny BLEs. Ciśnienie należy monitorować za pomocą cyfrowego czujnika znajdującego się u podstawy kaniuli. Należy stale regulować wysokość odpływu, aby przez cały czas trwania eksperymentu utrzymywać stabilne ciśnienie na poziomie 12 cm H₂O.

Na koniec elektrody bipolarne umieszcza się na sklepieniu lewego przedsionka oraz na górnej części prawego przedsionka. Teraz należy przygotować się do mapowania optycznego. Rozpocznij od ustawienia ostrości kamery CCD o wysokiej rozdzielczości i wysokiej szybkości na obszarze około 14 cm² wolnej ściany lewego przedsionka.

Następnie ustaw źródło światła laserowego tak, aby oświetliło ten obszar. Teraz wprowadź sztywny boreskop dwukanałowy o średnicy 10 milimetrów przez zastawkę mitralną, aby uzyskać bezpośrednie pole widzenia przez ścianę przednią lewej komory. Skieruj boreskop na powierzchnię wsierdzia tylnej części lewego przedsionka, aby zwizualizować cztery żyły płucne oraz płucny pęczek przegrody przedsionkowej.

Następnie zamocuj boreskop do drugiej kamery CCD poprzez adapter okularowy, wykorzystując ciekły światłowód o średnicy rdzenia 0,2 cala. Ustaw laser na kanale wzbudzenia boreskopu. Zsynchronizuj rejestrację z obu kamer CCD i skonfiguruj je tak, aby generowały prostokątny impuls TTL, który będzie służył do dalszego wyzwalania jednoczesnych pomiarów bipolarnych.

Aby przygotować układ do rejestracji optycznej, wstrzyknij od 5 do 10 ml dif four andep do serca i odczekaj 10 minut przed rozpoczęciem pomiarów mapowania optycznego. D four ANEP PS emituje fluorescencję wrażliwą na napięcie po pobudzeniu laserem o długości fali 532 nm. Po jego dodaniu niezwłocznie przystąp do rejestracji migotania przedsionków; aby wywołać migotanie przedsionków w warunkach ciągłego rozciągnięcia przedsionka, umieść elektrodę na górnej części LAA w celu stymulacji seryjnej (burst pacing) podczas migotania przedsionków.

Nagrywaj pięciosekundowe filmy w dwuminutowych odstępach czasu jednocześnie obiema kamerami. Kontynuuj rejestrację migotania przedsionków przez okres 50 minut; w zgromadzonych surowych danych zastosuj filtr górnoprzepustowy dla sygnałów bipolarnych o częstotliwości 3 Hz oraz filtr dolnoprzepustowy o częstotliwości 35 Hz. Aby przeanalizować sygnały elektryczne i optyczne, przekształć oba sygnały za pomocą algorytmu FFT.

W końcu, aby zidentyfikować obszary o wysokich wskaźnikach aktywacji i stworzyć gradienty częstotliwości, wygeneruj mapy częstotliwości dominującej z każdego filmu optycznego, wykorzystując filmy fazowe utworzone za pomocą transformacji Hilberta; można wówczas zidentyfikować trzy klasy wzorców aktywacji. Wzorzec rotora rozpoznaje się po obecności faz zbiegających się w punkcie osobliwym, który utrzymuje się przez więcej niż jeden obrót. Wzorzec przełamania definiuje się jako front fali pojawiający się w polu widzenia i rozprzestrzeniający się na zewnątrz w formie przypominającej tarczę.

Przestrzennie i czasowo zorganizowane fale okresowe definiuje się jako minimum cztery następujące po sobie fale okresowe wyłaniające się z tej samej lokalizacji, o podobnym kierunku i odstępie międzyfallowym. Podczas tego reprezentatywnego epizodu migotania przedsionków najwyższa częstotliwość dominująca była zlokalizowana w prawej dolnej żyle płucnej tylnej ściany lewego przedsionka. Obecność źródeł wysokiej częstotliwości w PLA jest zgodna z gradientami częstotliwości dominującej z lewej na prawą, obserwowanymi podczas procedur ablacyjnych w przypadku proksymalnego migotania przedsionków u ludzi.

Dalsza kwantyfikacja umożliwia korelację przestrzenną najwyższych częstotliwości dominujących z najczęstszym wzorcem aktywacji. Okazyjnie możliwe jest zidentyfikowanie długotrwałych rotorów zlokalizowanych w domenie najwyższych częstotliwości. W niektórych przypadkach identyfikuje się falę spiralną (scroll wave), będącą trójwymiarowym odpowiednikiem rotora, ponieważ stabilne centrum rotacji fali spiralnej pozostaje prostopadłe do powierzchni obszaru mapowania.

Rotor ten został zarejestrowany w endokardium PLA przy jednoczesnym przewodnictwie włóknistym w kierunku LAA. Dane korelują z gradientem częstotliwości między PLA a LAA, wynoszącym odpowiednio 9 i 6,4 herca. Rotory występują zazwyczaj częściej w PLA niż w LAA, co sugeruje, że reentry w obszarze PLA odgrywa kluczową rolę w utrzymywaniu arytmii.

Po opanowaniu metod chirurgicznych i technicznych eksperyment ten można przeprowadzić w ciągu dwóch lub trzech godzin. Istnieje kilka kluczowych punktów niezbędnych do pomyślnego wykonania doświadczenia.

Po pierwsze, kluczowe jest zapobieganie przedostawaniu się powietrza do twardego układu wieńcowego. Po drugie, ważne jest zidentyfikowanie wszystkich żył i tętnic, a następnie ich odpowiednie uszczelnienie. Po trzecie, należy dążyć do zminimalizowania ruchów i ilości zastosowanego barwnika fluorescencyjnego do sprzęgania oraz maksymalnie ograniczyć ekspozycję na światło wzbudzenia.

Opracowanie przedstawionego tutaj podejścia do mapowania endokardialno-epikardialnego otwiera przed badaczami drogę do szczegółowego zgłębiania dynamiki propagacji fal, w stopniu większym niż dotychczas i z wykorzystaniem wysoce relewantnych modeli zwierzęcych złożonych arytmii serca.