Mapowanie hamujących obwodów neuronalnych za pomocą fotostymulacji skanującej laserowo
6 października 2011
Niniejszy artykuł przedstawia podejście łączące fotostymulację za pomocą skanowania laserowego z rejestracją z całej komórki u myszy transgenicznych wykazujących ekspresję GFP w ograniczonych populacjach neuronów hamujących. Technika ta umożliwia szerokie mapowanie i analizę ilościową lokalnych obwodów synaptycznych specyficznych hamujących neuronów kory mózgowej.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie lokalnej organizacji funkcjonalnej hamujących obwodów neuronalnych. Procedura rozpoczyna się od przygotowania żywych skrawków mózgu z pierwotnej kory somatosensorycznej myszy. Kolejnym krokiem jest wizualizacja oraz rejestracja aktywności wybranych, ekspresujących GFP typów komórek hamujących w skrawku mózgu.
Po przeprowadzeniu fotostymulacji za pomocą skanowania laserowego z wykorzystaniem glutaminianu, stosuje się uwalnianie z klatek (uncaging), aby aktywować niewielkie grupy neuronów presynaptycznych jako pobudzające lub hamujące. Prądy postsynaptyczne są rejestrowane w interneuronach wykazujących ekspresję GFP. Ostatnim etapem jest przeprowadzenie fotostymulacji, analiza danych oraz wygenerowanie ilościowych map wkładu synaptycznego do rejestrowanych neuronów.
W ostateczności, fotostymulacja za pomocą skanowania laserowego w połączeniu z rejestracją z całej komórki umożliwia konstruowanie szczegółowych map wejść synaptycznych do konkretnych typów neuronów hamujących, co może pozwolić na określenie organizacji i funkcji lokalnych hamujących obwodów korowych. Technika oparta na fotostymulacji została zapoczątkowana przez dr. Larry'ego Katza i Neda Callowaya, a następnie rozwinięta przez dr. Carols Waboda, mojego promotora; dr Xing Z kształcił się u dr. Callowaya w Instytucie Salka, gdzie kierował wieloma badaniami nad obwodami interneuronalnymi. Nasza grupa obecnie rozszerza i kontynuuje te badania, analizując obwody interneuronalne.
Aby rozpocząć tę procedurę, należy uśmiercić mysz transgeniczną w drugim lub trzecim tygodniu po urodzeniu poprzez dekapitację, szybko usunąć mózg i umieścić go w zamrożonym i natlenionym roztworze do cięcia. Następnie, używając gogli GFP, należy dokonać wizualnej oceny mózgu w celu sprawdzenia ekspresji GFP. W kolejnym kroku, przy użyciu wibratomu, należy pociąć pierwotną korę somatosensoryczną na sekcje o grubości 400 µm.
Inkubować skrawki w A CSF zawierającym sacharozę, napowietrzonym mieszaniną 95%O2 i 5%CO2, w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez okres od 30 minut do jednej godziny. Następnie przenieść skrawki do standardowego A CSF w temperaturze pokojowej, przygotować laser do eksperymentu, a następnie włączyć system chłodzenia lasera oraz zasilacz. Następnie włączyć cały sprzęt związany z kontrolą fotostymulacji, w tym system zwierciadeł skanujących, modulator optyczny, migawkę elektroniczną oraz wzmacniacz wejściowy fotodiody.
Następnie włącz sprzęt elektrofizjologiczny, taki jak wzmacniacz Multi Clamp 700B oraz mikromanipulatory. Rejestracje elektrofizjologiczne, fotostymulacja i obrazowanie są przeprowadzane w komorze perfuzyjnej do skrawków zamontowanej na zmotoryzowanym stole mikroskopu. Po tym włącz kamerę obrazującą; skrawki będą wizualizowane w mikroskopie pionowym z wykorzystaniem optyki DIC w podczerwieni oraz optyki epi-fluorescencyjnej za pomocą systemu obrazowania.
Następnie otwórz oprogramowanie FS oparte na środowisku MATLAB oraz oprogramowanie kamery Q capture na monitorze. Przed rozpoczęciem eksperymentu sprawdź system fotostymulacji laserowej i upewnij się, że jest on w stanie roboczym. Umieść kartkę papieru pod obiektywem mikroskopu 4x, aby obserwować wzór skanowania laserem podczas pracy systemu.
Aby wykonać mikroelektrodę o oporności od czterech do sześciu MΩ, należy wyciągnąć elektrodę szklaną za pomocą wyciągarki do pipet. Następnie należy napełnić elektrodę roztworem wewnętrznym zawierającym 0,1% biotyny w celu znakowania komórek i identyfikacji morfologicznej. W kolejnym kroku należy włączyć system perfuzji ciśnieniowej, aby wpompować CSF do komory.
Należy zapewnić stały poziom płynu wynoszący 2,0 mm powyżej skrawka w komorze. Alikwot roztworu zapasowego klatkowanego glutaminianu MNI dodaje się do 25 ml krążącego A CSF, aby uzyskać stężenie 0,2 mM klatkowanego glutaminianu. Następnie jeden skrawek mózgu przenosi się do komory rejestracyjnej.
Uruchom system obrazowania, aby sprawdzić jakość skrawka i anatomicznie zlokalizować pierwotny obszar somatosensoryczny. Następnie przymocuj skrawek za pomocą specjalnie wykonanego platynowego pierścienia ze sznurkiem, uważając, aby kotwica nie znajdowała się nad obszarem mózgu przeznaczonym do rejestracji. Zwizualizuj komórki za pomocą obiektywu 60 x, opierając się na wizualizacji ekspresji GFP pod fluorescencyjnym mikroskopem A DIC.
Zidentyfikuj i wybierz hamujące typy komórek. Należy pamiętać, że rejestracja będzie prowadzona pod kontrolą wizualną z wykorzystaniem podczerwieni w mikroskopii DIC. Monitorowanie wideo oraz przełączanie pomiędzy trybem DIC a fluorescencyjnym jest niezbędne do potwierdzenia lokalizacji komórki GFP podczas opuszczania elektrody do komórki docelowej.
Stosując konwencjonalną technikę patch-clamp. Najpierw przyłóż dodatnie ciśnienie do elektrody. Przesuń ją blisko powierzchni komórki, aby utworzyć wyraźne wgłębienie na docelowej błonie komórkowej.
Następnie szybko przyłóż podciśnienie, aby utworzyć gigauszczelnienie (giga seal) i przebić błonę komórki, monitorując odpowiedzi na wstrzykiwanie prądu na monitorze wideo. Po przebiciu błony wykonaj zdjęcia zarejestrowanego neuronu wewnątrzstałego wykazującego ekspresję GFP przy powiększeniu 60x w trybie DIC oraz fluorescencyjnym w celu weryfikacji online. Przed zebraniem danych z fotostymulacji wstrzyknij hiperpolaryzujące i depolaryzujące impulsy prądowe, aby zbadać podstawowe właściwości elektrofizjologiczne każdej komórki.
Po ustabilizowaniu i uzyskaniu rejestracji z całej komórki (whole cell) przy dobrej rezystancji dostępu, która zazwyczaj wynosi mniej niż 20 mega ohms, należy zmienić powiększenie obiektywu mikroskopu z 60 x na 4 x w celu przeprowadzenia fotostymulacji za pomocą skanowania laserowego, pozyskać obraz skrawka przy powiększeniu 4 x i wykorzystać go do naprowadzania oraz rejestracji miejsc fotostymulacji. Parametry fotostymulacji i akwizycji danych należy ustawić, aktywując moduł przełącznika konfiguracji oprogramowania phys. Należy zastosować jednosekundowy impuls laserowy o mocy około 20 milliwatts z odstępem między stymulacjami wynoszącym jedną sekundę.
W celu mapowania fotostymulacji należy zarejestrować ślady danych o długości jednej sekundy przy częstotliwości próbkowania 10 kHz. Następnie należy wczytać obraz przekroju 4x do modułu mapującego programu phys. Należy zdefiniować położenie somy i ustawić miejsca fotostymulacji w układzie 16 na 16 o wymiarach 80 µm na 80 µm.
Odstępy wokół lokalizacji komórki, obejmujące wszystkie warstwy kory. Następnie należy zmapować profil pobudzenia zarejestrowanego neuronu poprzez analizę miejsc występowania potencjałów czynnościowych w odpowiedzi na fotostymulację w trybie clamp prądowy. Nasze intuicyjne oprogramowanie z funkcją wyświetlania w czasie rzeczywistym ułatwia przeprowadzanie eksperymentów z mapowania.
Następnie należy zmapować połączenia lokalnego obwodu pobudzającego poprzez detekcję pobudzających prądów postsynaptycznych z rejestrowanej komórki. Przy skanowaniu laserowym w różnych lokalizacjach, należy utrzymać potencjał komórki na poziomie -70 mV w trybie clamp napięciowego, aby wykryć dośrodkowe prądy pobudzające. Następnie mapowanie pobudzających prądów postsynaptycznych należy powtórzyć dwa do trzech razy, obracając lub odwracając wzór fotostymulacji. Aby zmapować połączenia lokalnego obwodu hamującego, należy wykryć hamujące prądy postsynaptyczne z rejestrowanej komórki.
W tym przypadku utrzymuj potencjał komórki bliski zeru miliwoltów, a konkretnie na poziomie -15 mV w trybie clampy napięciowej, aby wykryć wychodzące prądy hamujące. Po zakończeniu wszystkich pomiarów fizjologicznych ostrożnie wyjmij elektrodę z rejestrowanej komórki. Wyjmij skrawek mózgu z komory, a następnie utrwal go w 4% paraformaldehydzie przez noc i przeprowadź barwienie komórek rejestrowanych przeciwko biotynie.
W tym eksperymencie kombinację ekspresji GFP, wewnątrzkomórkowej elektrofizjologii oraz cech morfologicznych wykorzystano do klasyfikacji neuronów hamujących. Przedstawiono przykład oraz mapę surowych danych ilustrującą laserową fotostymulację skanującą, która umożliwia szerokie mapowanie lokalnych połączeń w obwodach korowych z rejestrowanym neuronem hamującym. Poniżej znajdują się przykłady quantitative input maps z kodowaniem kolorystycznym, pochodzące z surowych zapisów pokazanych przed chwilą na Rysunku D. Amplitudy zdarzeń synaptycznych wykrytych w rejestrowanym interneuronie są zakodowane kolorami i nałożone topograficznie na miejsca fotostymulacji.
Lokalizację ciała komórki zaznaczono czerwonym pustym okręgiem na pasku skali. Kolory ciepłe wskazują silne wejścia synaptyczne, a kolory zimne wskazują słabą łączność lub brak połączeń z docelową komórką. Podobnie, rycina E przedstawia liczbę zdarzeń synaptycznych na próbkowaną lokalizację odblokowania (uncaging) w odniesieniu do rejestrowanego neuronu.
Rysunek F przedstawia czas wystąpienia pierwszego wykrytego zdarzenia synaptycznego w rejestrowanej komórce po fotostymulacji, zgodnie z paskiem skali. Kolory ciepłe oznaczają krótki czas dopływu (latencję), a kolory chłodniejsze wskazują na dłuższą latencję synaptyczną. Zatem LSPS umożliwia tworzenie szczegółowych map pozycji, siły, latencji oraz liczby wejść wpływających na konkretne typy neuronów hamujących.
Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest zachowanie cierpliwości, zapewnienie czystych warunków eksperymentalnych oraz bardzo ostrożna i efektywna zmiana powiększenia obiektywu z wysokiego na niskie. Następnie należy sprawnie posłużyć się oprogramowaniem.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę mapowania i analizy lokalnych obwodów synaptycznych specyficznych hamujących neuronów korowych przy użyciu laserowej fotostymulacji skanującej w połączeniu z rejestracją z całej komórki u myszy transgenicznych ekspresyjących GFP. Podejście to umożliwia szczegółowe badanie organizacji funkcjonalnej obwodów neuronów hamujących.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Obwody neuronalne
Wprowadzenie
- Neurony hamujące odgrywają kluczową rolę w regulacji obwodów neuronalnych.
- Myszy transgeniczne wykazujące ekspresję GFP umożliwiają ukierunkowane badania specyficznych populacji neuronów.
- Zrozumienie lokalnych obwodów synaptycznych jest niezbędne do wyjaśnienia funkcji mózgu.
- Laserowa fotostymulacja skanująca jest potężnym narzędziem do badania oddziaływań synaptycznych.
Cel badania
- Zbadanie lokalnej organizacji funkcjonalnej hamujących obwodów neuronalnych.
- Zmapowanie wejść synaptycznych do konkretnych neuronów hamujących.
- Pogłębienie zrozumienia dynamiki synaptycznej w sieciach korowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie żywych skrawków mózgu z pierwotnej kory somatosensorycznej myszy.
- Wizualizacja i rejestracja sygnałów z wytypowanych, ekspresujących GFP typów komórek hamujących.
- Fotostymulacja skaningowa laserem w celu aktywacji neuronów presynaptycznych.
- Analiza danych w celu wygenerowania ilościowych map wejścia synaptycznego.
Główne wyniki
- Pomyślne mapowanie lokalnych obwodów synaptycznych w specyficznych neuronach hamujących.
- Ilościowa analiza wejść synaptycznych ujawniła odmienne wzorce.
- Wykazano skuteczność połączonej techniki w badaniu obwodów neuronalnych.
- Dostarczono informacji na temat organizacji funkcjonalnej sieci hamujących.
Wnioski
- Metoda ta oferuje solidne podejście do badania obwodów hamujących w mózgu.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia oddziaływań synaptycznych w neuronach korowych.
- Technikę tę można zastosować do dalszego badania dynamiki obwodów neuronalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mapowanie hamujących obwodów neuronalnych zapewnia mechanistyczne ograniczenie ryzyka w procesie walidacji celów w odkrywaniu leków ukierunkowanych na OUN poprzez ujawnienie funkcjonalnej organizacji synaptycznej. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w strategiach modulacji szlaków i umożliwia opartą na danych selekcję hipotez terapeutycznych. Technika ta poprawia ciągłość translacyjną od etapu odkrywania leku po przedkliniczną ocenę efektów działania substancji na poziomie obwodów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie wejść synaptycznych do konkretnych podtypów neuronów hamujących, co pozwala na wyjaśnienie zaangażowania poszczególnych szlaków.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez ilościową ocenę modulacji celu na poziomie obwodu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez ujawnienie funkcjonalnych konsekwencji inhibicji celu dla dynamiki lokalnej sieci.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszego przesiewu poprzez zdefiniowanie podstawowych wzorców sygnałów synaptycznych.
- Powtarzalność: Generuje ilościowe mapy wejść synaptycznych, które umożliwiają standaryzowane porównania między różnymi warunkami eksperymentalnymi.
- Użyteczność platformy: Wspiera skalowalną ocenę związków chemicznych, zapewniając odczyty odpowiedzi neuronalnej na poziomie obwodów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Mapowanie obwodów hamujących w układach istotnych dla danej jednostki chorobowej w celu dostosowania ich do translacyjnych strategii biomarkerowych.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączenie mapowania obwodów w fazie odkryć z przedkliniczną walidacją efektów działania leków na poziomie sieciowym.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wspieranie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez ujawnianie kompensacyjnych lub paradoksalnych odpowiedzi obwodów na modulację celu.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania – od testowania hipotez dotyczących celu, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną – dostarczając odczytów funkcjonalnych na poziomie obwodów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez mapowanie organizacji synaptycznej neuronów hamujących.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki powtarzalnej kwantyfikacji wejść synaptycznych do rejestrowanych neuronów.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów siły synaptycznej, latencji oraz liczby wejść, co ułatwia porównywanie warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez umożliwienie oceny efektów działania leków na poziomie obwodów w modelach istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako możliwość wielokrotnego wykorzystania do iteracyjnego mapowania obwodów w różnych klasach celów i modelach chorób.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu poprzez mechanistyczną redukcję ryzyka efektów na poziomie obwodów.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność mapowania wkładu synaptycznego pomiędzy laboratoriami i badaniami.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji go/no-go poprzez ograniczenie biologicznego ryzyka na późnych etapach, wynikającego z nieprzewidzianych adaptacji obwodów.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko w oparciu o ilościowe profile modulacji obwodów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy eksperckiej z zakresu elektrofizjologii, laserowej fotostymulacji skanującej oraz pracy z myszami transgenicznymi.
- Zależność od systemów laserowej fotostymulacji skanującej, zestawów elektrofizjologicznych oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Konieczność standaryzacji parametrów stymulacji, ustawień clampy napięciowej oraz potoków analizy danych pomiędzy zespołami.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji przy zastosowaniu metody w różnych obszarach kory mózgowej lub modelach chorobowych.
- Ograniczenie wynikające z żywotności tkanki oraz konieczności użycia zdrowych skrawków mózgu w celu zapewnienia wiarygodnych odpowiedzi synaptycznych.
