Wzornictwo powierzchni metodą litografii plazmowej do tworzenia sieci komórkowych
14 czerwca 2011
Opracowano wszechstronną technikę litografii plazmowej do tworzenia stabilnych wzorów powierzchniowych służących do kierowania adhezją komórkową. Technika ta może być stosowana do tworzenia sieci komórkowych, w tym takich, które naśladują naturalne tkanki, i była wykorzystywana do badania kilku odrębnych typów komórek.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest stworzenie mikrośrodowisk komórkowych w celu zbadania zagadnień biologicznych związanych z zachowaniem pojedynczych komórek oraz grup komórek, które zachodzą w wymiarach mikro- i nanometrycznych. Osiąga się to najpierw poprzez zaprojektowanie szablonów, które ostatecznie będą kierować rozmieszczeniem komórek. Następnie projekty te są przenoszone na powierzchnie wzorowane za pomocą fotolitografii, co umożliwia stworzenie form do ekranowania plazmą przy użyciu soft litografii.
Na koniec formy ekranujące układa się w kształcie statywu w szalce Petriego, aby umożliwić selektywną ekspozycję powierzchni podłoża na plazmę, co pozwoli na utworzenie chemicznego wzoru wrażliwego na komórki w obszarach znajdujących się pod każdą formą. Uzyskane wyniki mogą wykazać, w jaki sposób zachowanie komórki zależy od jej mikrośrodowiska oraz oddziaływań z sąsiednimi komórkami. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące wpływu mikrośrodowisk na zachowanie komórek, na przykład w kwestii tego, jak interakcje między grupami komórek wpływają na zjawiska wyższego rzędu.
A w jaki sposób podkomórkowe sygnały w skali nanometrycznej wpływają na takie funkcje jak migracja i różnicowanie komórek? Najpierw należy użyć kleju super glue, aby przymocować szkiełko z wzorem do stosu pustych szkiełek. Następnie należy przygotować z folii aluminiowej pojemnik nieco większy niż stos szkiełek i wystarczająco duży, aby pomieścić 30 gramów polidimetylosiloksanu lub PDMS.
Umieść stos szkiełek w pojemniku, a następnie wlej PDMS nad stos szkiełek, aby utworzyć wstępną formę. Następnie odgazuj PDMS, umieszczając pojemnik w komorze próżniowej. Usuń pęcherzyki powietrza obecne w PDMS, kilkakrotnie szybko zdejmując i nakładając palec na rurkę zaworu wlotowego, aby na krótko dopuścić przepływ powietrza do komory.
Zawór pozostaje zamknięty przez pięć minut nieprzerwanego odgazowywania. Następnie należy pozostawić PDMS do utwardzenia w czystej komorze z przepływem laminarnym w temperaturze pokojowej przez jeden do dwóch dni. Po utwardzeniu PDMS odrywa się od matrycy wzorcowej, tworząc formę.
Następnie do formy głównej wlej cienką warstwę sześciu gramów dwuskładnikowej żywicy epoksydowej, którą właśnie mieszano przez jedną minutę. Bezzwłocznie odgazuj żywicę, stosując wielokrotne cykle usuwania pęcherzyków powietrza, zanim żywica stężeje. Po pozostawieniu odgazowanej żywicy w spokoju przez godzinę, zostanie ona częściowo utwardzona.
Dodaj do formy więcej żywicy epoksydowej bez odgazowywania, aby uzyskać grubszą strukturę, którą łatwiej będzie manipulować w kolejnych etapach. Następnie pozostaw żywicę do utwardzenia na jeden do dwóch dni. Po utwardzeniu formy epoksydowej wyjmij ją z matrycy PDMS, a następnie owiń formę epoksydową taśmą, aby utworzyć pojemnik.
Następnie można stworzyć formę roboczą, wlewając PDMS na formę epoksydową, odgazowując PDMS i utwardzając nową formę przez jeden do dwóch dni. Po utwardzeniu formy roboczej należy oddzielić ją od epoksydu, a następnie przechowywać obie formy w szalkach Petriego w szczelnym plastikowym pojemniku wewnątrz dygestorium, aby zachować czystość. Aby przygotować formę do strukturyzowania powierzchni, należy wyciąć żyletką małe fragmenty formy roboczej i umieścić je w szalce Petriego.
Położenia tych sekcji formy należy oznaczyć na spodniej stronie szalki Petriego permanentnym markerem, obrysowując miejsca, w których znajdują się sekcje formy; należy utworzyć z sekcji statyw i odczekać, aż statyw zapewni konformalny kontakt między formą roboczą a powierzchnią szalki Petriego. Należy spojrzeć na dno szalki, aby potwierdzić prawidłowe rozmieszczenie, co potwierdza obecność kanałów widocznych gołym okiem lub za pomocą małej soczewki powiększającej. Następnie cały zespół należy umieścić w komorze plazmowej.
Rozpocząć obróbkę plazmą po zakończeniu procedury obróbki plazmowej. Usunąć formę i układ obciążników, a następnie umieścić szalkę Petriego w komorze z laminarnym przepływem powietrza pod światłem UV na 10 minut w celu sterylizacji. Przechowywać szalkę w tym miejscu do momentu zasiewu komórek.
Rozcieńczyć wybrane komórki eksperymentalne w standardowej pożywce hodowlanej, aby uzyskać pożądany stopień konfluencji. Po umieszczeniu na wzorowanej powierzchni szalki Petriego, nalać do niej 3 mL zawiesiny komórkowej. Inkubować wzorowaną szalkę Petriego w temperaturze 37 °C, przy 5% carbon dioxide i 100% humidity przez okres od kilku godzin do kilku dni, aby umożliwić komórkom zgromadzenie się w wzorze utworzonym przez plazmę.
Wzorcowanie jest sprawdzane za pomocą mikroskopii kontrastowej. Podczas hodowli komórek neuroblastoma codziennie dodaje się 10 µM kwasu retinowego, aż do momentu zaobserwowania różnicowania komórek do stanu przypominającego neurony. Standardową pożywkę do hodowli komórkowej należy wymieniać co trzy do czterech dni.
Typowym wynikiem zastosowania techniki litografii plazmowej jest utworzenie wzoru komórek przypominającego określoną strukturę sztuczną lub naturalną. Przykład można zobaczyć na tej rysunku, przedstawiającym neurony zróżnicowane za pomocą kwasu retinowego na wzorze linii. Tutaj, na tym rysunku, przedstawiono stworzone linie i sieci neuronów; do tego celu można wykorzystać również inne typy komórek, co widać na dwóch kolejnych rysunkach – ten rysunek pokazuje ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej, a ten rysunek przedstawia komórki mięśni szkieletowych C2C12 tworzące widoczne tutaj siatki.
Materiały takie jak polilizyna mogą być również nakładane w formie wzorów, aby ułatwić przywieranie określonych typów komórek oraz do innych zastosowań. Po wykonaniu tej procedury można wprowadzić dodatkowe elementy, takie jak mikrofluidyka, sondowanie komórek lub manipulacje genetyczne specyficznych białek, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. jak kombinacje bodźców wpływają na zachowanie komórek w skali indywidualnej oraz w strukturach wyższego rzędu?
Przegląd
Opracowano wszechstronną technikę litografii plazmowej w celu tworzenia stabilnych wzorów powierzchniowych kierujących adhezją komórkową. Metoda ta umożliwia formowanie sieci komórkowych naśladujących naturalne tkanki i ułatwia badanie różnych typów komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Neuronauka
- Biomateriały
Wstęp
- Zrozumienie zachowania komórek w skali mikro- i nanometrycznej jest kluczowe dla badań biologicznych.
- Mikrośrodowiska komórkowe znacząco wpływają na zachowanie pojedynczych komórek oraz ich grup.
- Litografia plazmowa dostarcza metody tworzenia kontrolowanych środowisk do badania tych zachowań.
- Wcześniejsze techniki cechowały się brakiem wszechstronności w tworzeniu wzorów dla różnych typów komórek.
Cel badania
- Opracowanie metody tworzenia mikrośrodowisk komórkowych sterujących rozmieszczeniem komórek.
- Zbadanie wpływu mikrośrodowisk na zachowanie i interakcje komórek.
- Zbadanie wpływu sygnałów w skali nanometrycznej na funkcje komórkowe, takie jak migracja i różnicowanie.
Zastosowane metody
- Projektowanie szablonów do rozmieszczania komórek.
- Wykorzystanie fotolitografii do tworzenia form do ekranowania plazmą.
- Stosowanie obróbki plazmą w celu generowania wzorów chemicznych na powierzchniach.
- Wysiewanie komórek na wzorcowane powierzchnie i obserwacja ich zachowania.
Główne wyniki
- Pomyślne utworzenie wzorów komórkowych przypominających struktury naturalne.
- Wykazanie różnicowania się komórek neuroblastomy do stanów przypominających neurony.
- Obserwacja oddziaływań między różnymi typami komórek na powierzchniach wzorowanych.
- Podkreślenie roli mikrośrodowisk w wpływaniu na zachowanie komórek.
Wnioski
- Technika litografii plazmowej jest skuteczna w badaniu zachowania komórek w kontrolowanych środowiskach.
- Metodę tę można dostosować do różnych typów komórek i pytań badawczych.
- W przyszłych badaniach można zastosować dodatkowe techniki, aby dalej zgłębiać interakcje komórkowe.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wzorowanie powierzchni za pomocą litografii plazmowej umożliwia precyzyjne kształtowanie mikrośrodowisk komórkowych, co wspiera wysokorozdzielcze badania nad zachowaniem i interakcjami komórek. Możliwość ta ma kluczowe znaczenie dla weryfikacji wstępnych hipotez badawczych oraz rozwoju modeli predykcyjnych formowania tkanek i sygnalizacji komórkowej. Stabilność tej metody oraz jej kompatybilność z różnymi typami komórek sprawiają, że stanowi ona uniwersalną platformę dla badań translacyjnych i opracowywania modeli przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju BioPharma
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia systematyczną analizę odpowiedzi komórkowych na określone sygnały mikrośrodowiskowe.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez izolowanie zmiennych, takich jak migracja, adhezja i różnicowanie.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów poprzez kontrolowane tworzenie sieci komórkowych.
- Zwiększa pewność predykcyjną w badaniach nad odkrywaniem szlaków sygnałowych i fenotypów.
Przesiew i opracowanie testu
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne podłoża wzorzyste do ilościowych analiz komórkowych.
- Umożliwia skalowalny proces przygotowania powierzchni gotowych do analiz w celu przesiewania związków.
- Wspiera rzetelną ocenę zachowania komórek w określonych ograniczeniach przestrzennych.
- Pozwala na ponowne wykorzystanie platformy dla wielu typów komórek i warunków eksperymentalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie sieci komórkowych in vitro do architektur tkankowych istotnych dla danej choroby w celu zachowania ciągłości translacyjnej.
- Ułatwia długoterminowe badania nad różnicowaniem, adaptacją i sygnalizacją międzykomórkową.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój modeli przedklinicznych poprzez umożliwienie dyskretnej manipulacji środowiskami komórkowymi.
- Usprawnia odkrywanie biomarkerów dzięki kontrolowanej obserwacji oddziaływań komórkowych.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Ta metoda litografii plazmowej integruje etapy od wczesnych odkryć, poprzez rozwój testów, aż po badania przedkliniczne, umożliwiając płynną weryfikację hipotez i walidację modeli.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badania nad zachowaniem komórek i formowaniem sieci w oparciu o hipotezy, przy zastosowaniu określonych wzorców chemicznych.
- Screening: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników do porównywania odpowiedzi komórkowych na zmienne eksperymentalne.
- Analityka: Zapewnia wysokotreściowe odczyty dla parametrów migracji, adhezji i różnicowania.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z modelami przedklinicznymi poprzez naśladowanie naturalnych struktur tkankowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje stabilną, biokompatybilną platformę, którą można dostosować do wielu programów B+R i różnych typów komórek.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanisticzną w badaniach opartych na komórkach.
- Wartość operacyjna: Dostarcza standaryzowane, skalowalne i powtarzalne podłoża wzorcowane dla różnorodnych schematów pracy.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne pod kątem kapitałowym rozwijanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów badawczych i przedklinicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu chemii powierzchni, fotolitografii oraz technik hodowli komórkowej.
- Niezbędny jest dostęp do komór plazmowych, sterylnych dygestoriów oraz infrastruktury mikroskopowej.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności doświadczeń w różnych laboratoriach i ośrodkach.
- Metoda jest możliwa do zaadaptowania do różnych podłoży polimerowych i jest kompatybilna z wieloma typami komórek.
- Stabilność wzoru umożliwia prowadzenie długoterminowych badań, jednak w określonych zastosowaniach może wymagać optymalizacji.
