Badania skurczu i rozkurczu tętnicy krezkowej z wykorzystaniem zautomatyzowanej miografii drucianej

W niniejszej procedurze wykorzystuje się szczury linii doll wrażliwe na sól oraz odporne na sól w celu porównania reaktywności tętnic oporowych krezkowych na wapń zewnątrzkomórkowy pod napięciem wywołanym fenylefryną. W tym celu najpierw izoluje się łuk krezkowy od zwierząt, a następnie preparuje gałęzie tętnic oporowych. Następnie pierwszy z dwóch drutów ze stali nierdzewnej przewleka się przez krótki odcinek wypreparowanej tętnicy, a naczynie montuje się w komorze graficznej.

Następnie drugi drut ze stali nierdzewnej jest przewleczony przez światło naczynia równolegle do pierwszego drutu. W kolejnym kroku zamocowane naczynie zostaje rozciągnięte do znormalizowanego obwodu wewnętrznego. Ostatnim etapem procedury jest reaktywacja naczynia poprzez poddawanie go działaniu powtarzających się aplikacji fenylefryny oraz rozluźnianie za pomocą kumulacyjnych aplikacji wapnia.

Ostatecznie wyniki wykazują zmiany napięcia w naczyniu, które można przekształcić w krzywą odpowiedzi wapniowej i wykorzystać do wyznaczenia wartości EC 50. Dla porównania: po raz pierwszy pomyśleliśmy o zastosowaniu tej metody, gdy odkryliśmy, że sieć nerwowa w ciałach jamistych szczura wykazuje ekspresję sprzężonego z białkiem G receptora wrażliwego na wapń.

Można to badać w ten sam sposób, co w przypadku receptorów goryczy AIC, które są aktywowane przez agonistę. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotykać trudności, ponieważ warstwy śródbłonka i mięśni gładkich są cienkie. Naczynia są łatwo uszkadzane.

Jeśli tak się stanie, właściwości mechaniczne tych naczyń mogą zostać upośledzone. Na początek należy przygotować obszar roboczy oraz instrumenty chirurgiczne. Zznieczone zwierzę ułożyć na plecach i przetrzeć brzuch alkoholem.

Po wykonaniu laparotomii w linii pośrodkowej, za pomocą nożyczek usunąć około 85 centymetrów jelita, w tym tętnicę krezkową górną. Odciąć koniec proksymalny blisko odźwiernika oraz koniec dystalny w pobliżu złącza kątniczo-krętniczego. Wycięty odcinek umieścić w powlekonej płytce Petriego zawierającej sól fizjologiczną lub PSS w temperaturze pokojowej.

Przytwierdź proksymalny koniec jelita po prawej stronie, a następnie przytwierdź pozostałą część jelita, poruszając się w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Następnie wypreparuj odcinek tętnicy krezkowej zawierający odgałęzienia drugie i trzecie oraz fragment jelita od strony proksymalnej. Zidentyfikuj V-kształtny punkt rozgałęzienia tętnicy krezkowej i oddziel go od żyły.

Za pomocą pęsety delikatnie odsunąć tkankę tłuszczową i łączną, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z tętnicą. W celu rozpoczęcia montażu naczynia, należy wyciąć dwa segmenty tętnicy o długości około two millimeters. Do otwarcia światła tętnicy można użyć końcówki czterocentymetrowego drutu ze stali nierdzewnej bez zawartości wolframu o średnicy 40 micrometer.

Następnie za pomocą precyzyjnej pęsety wprowadź drut do światła każdej tętnicy. Uważając, aby nie uszkodzić śródbłonka, napełnij komorę z graftem mięśniowym PSS w temperaturze 37°C. Używając pęsety, przenieś segment naczynia z prowadzonym drutem do komory.

Następnie przenieś wycięty proksymalny odcinek naczynia do komory mojografu i pociągnij za jego koniec wzdłuż drutu, aby wprowadzić go do naczynia. Unikaj rozciągania naczynia. Zabezpiecz bliski koniec drutu, obracając go przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, pod bliską śrubą mocującą w prawym zacisku połączonym z mikrometrem.

Chwyć wolny koniec drutu pęsetą i przymocuj go, obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara, pod dalszą śrubą mocującą w prawym ramieniu zacisku, upewniając się, że odcinek naczynia wzdłuż drutu znajduje się w szczelinie między ramionami, nie dotykając samego zacisku. Rozsuń ramiona zacisku za pomocą śrub. Ustaw drugi drut równolegle do naczynia i wprowadź go do przeciwległego końca światła naczynia.

Ostrożnie wprowadź drut przez światło segmentu naczynia jednym ruchem, używając już zamocowanego drutu jako prowadnicy. Trzymaj drut w odległości około jednego centymetra od naczynia, aby uniknąć jego rozciągnięcia podczas manewru oraz aby nie dotykać śródbłonka. Skręć szczęki i upewnij się, że drugi drut montażowy przesuwa się pod pierwszym, który został zabezpieczony po prawej stronie.

Przymocuj bliższy koniec drugiego drutu w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara pod bliższą śrubą mocującą lewego szczęki połączonej z przetwornikiem. Przymocuj dalszy koniec drutu pod śrubą mocującą na lewej szczęce i dokręć ją, aby naciągnąć drut. Po zakończeniu montażu odczekaj 30 minut w celu wyrównania temperatury do 37 °C.

Po osiągnięciu stanu równowagi silnik zostaje zresetowany z menu montażu i rozpoczynana jest procedura normalizacji, która rozciąga naczynie do znormalizowanego obwodu wewnętrznego. Aby rozpocząć, należy otworzyć menu normalizacji i ustawić docelowe ciśnienie transmuralne na 13.3 kilopascals. Następnie należy ustawić czas trwania każdego z etapów normalizacji na 60 seconds.

Stosunek IC 1 do IC 100 powinien wynosić 0,9, a kalibracja IP powinna być ustawiona na tryb „two star delta”. Należy zmierzyć długość zamontowanej tętnicy krezkowej, odczytując wartości z okularu mikroskopu, gdy linie celownicze pokrywają się z przeciwległymi końcami odcinka naczynia. Po normalizacji naczynia są reaktywowane poprzez wykonanie standardowego startu, składającego się z serii stymulacji i okresów wypłukiwania.

Najpierw należy założyć pokrywę komory miograficznej i rozpocząć napowietrzanie mieszaniną 95% powietrza i 5% dwutlenku węgla. Napełnij komorę świeżym roztworem PSS zawierającym 100 µM kwasu askorbinowego. Wywołaj skurcz naczynia za pomocą 5 µM fenylefryny (PE) przez pięć minut, a następnie przemyj naczynie czterokrotnie buforem PSS. Po ostatnim płukaniu ponownie napełnij komorę roztworem PSS i odczekaj trzy minuty przed ponownym napełnieniem komory PSS i wywołaniem skurczu za pomocą PE. Jak wykazano wcześniej, tętnica jest teraz gotowa do eksperymentu.

Zmierz rozkurcz skurczonych naczyń poprzez kumulatywne dodawanie rosnących stężeń chlorku wapnia. Niniejsza tabela pokazuje, że napięcia podstawowe po zastosowaniu fenylefryny różniły się u szczurów Wistar DS (wrażliwych na sól) oraz DR (opornych na sól). Ten zapis ze szczura Wistar przedstawia rozkurcz tętnic skurczonych PE przy kumulatywnym dodawaniu wapnia; rozkurcz ten był znacznie upośledzony w tkankach szczurów DS w porównaniu ze szczurami Wistar oraz w porównaniu ze szczurami DR. Jak widać tutaj, różnice w wrażliwości na wapń są widoczne na krzywych odpowiedzi na wapń, a także przy obliczaniu wartości EC 50.

W końcu szczury DS wykazują obniżenie ekspresji receptora wyczuwającego wapń w tętnicach w porównaniu do szczurów Dr. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu dwóch godzin, jeśli jest wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak porównywać reaktywność naczyniową małych tętnic jelitowych na związki egzogenne w warunkach izometrycznych.