Wykorzystanie pułapki optycznej do badania oddziaływań gospodarz-patogen w dynamicznym obrazowaniu żywych komórek

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykorzystanie pułapki optycznej w połączeniu z konfokalną mikroskopią z dyskiem wirującym do obserwacji interakcji między gospodarzem a patogenem w czasie rzeczywistym. Osiąga się to poprzez uprzednie naniesienie wybranych patogenów na szkiełko nakrywkowe z komorką. Następnie wybierana jest cząstka, która zostaje przechwycona za pomocą pułapki optycznej.

Na koniec cząsteczka jest kierowana do wybranej komórki, co przedstawiono tutaj. Pułapkowanie optyczne może być skuteczną metodą kontrolowania dwóch cząsteczek w celu obserwacji dynamicznych oddziaływań wewnątrzkomórkowych.

Metoda ta pozwala odpowiedzieć na istotne pytania dotyczące interakcji między gospodarzem a patogenem w dziedzinach chorób zakaźnych i immunologii, w tym na pytanie, jaki jest wpływ na fagocytozę w sytuacji uzyskania pełnej kontroli nad relacjami przestrzennymi między komórkami gospodarza a patogenami, a także czy kolejność pochłaniania patogenów przez komórkę fagocytarną wpływa na dojrzewanie fagosomu. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ warunki pułapkowania muszą zostać zoptymalizowane dla różnych typów komórek i kulek. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, gdyż proces konfiguracji i integracji tarczy wirującej jest złożony.

Koncepcja układu konfokalnego w odniesieniu do pułapki optycznej jest trudna do przedstawienia ze względu na konieczność precyzyjnego ustawienia wszystkich komponentów optycznych. Pozyskaj interesujący badacza patogen. Na przykład w tym przypadku 300 mikrolitrów *Candida albicans* hodowanej przez noc w pożywce płynnej zostaje pobranych z kultury, a następnie patogeny są przeniesione do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 mililitra.

Następnie przemyj patogeny trzykrotnie przy około 1300 Gs przez pięć minut w temperaturze pokojowej, odsysając nadsącz i pozostawiając osad nienaruszony, za każdym razem resuspendując w PBS i poddając sonikacji. Po trzecim przemyciu resuspenduj osad w 500 µL PBS. Następnie rozpuść 1 mg barwnika DiO w 100 µL dimetyloformamidu, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mg/mL.

Następnie do probówki z reakcją zawierającej przemyte patogeny dodaje się 3 µL mieszaniny barwników. Probówki należy owinąć folią, ponieważ barwniki są światłoczułe, a następnie wstrząsać próbką w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Po tym czasie próbkę należy odwirować i przemyć w PBS 3 razy, analogicznie jak poprzednio. Po ostatnim przemyciu osad resuspenduje się w 300 µL PBS.

Podgrzać medium z trypsyną oraz PVS do 37°C w łaźni wodnej. Przemyć 10-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej z makrofagami RAW 264.7 dwukrotnie za pomocą PBS, odsysając PBS po każdym płukaniu. Następnie pokryć powierzchnię płytki 5 ml trypsyny i inkubować płytkę przez 5 minut w temperaturze 37°C.

Następnie delikatnie opukaj bok płytki, aby odczepić komórki od jej powierzchni, uważając, by nie rozpryskać trypsyny poza płytkę. Teraz dodaj do płytki pięć mililitrów pożywki i przenieś mieszaninę do probówki reakcyjnej.

Po odwirowaniu i otrzymaniu osadu, odessać medium, uważając, aby nie zaburzyć osadu komórkowego, a następnie zawiesić osad w 10 ml medium. Do każdej komory szkiełka z komorami dodać 400 µL medium, a następnie do każdej komory dodać pięć µL zawiesiny komórkowej. Pozostawić komórki do wzrostu na noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.

Wyjmij szkiełko z komorami z inkubatora i pipetą nanieś od 5 do 10 µL wcześniej przygotowanych, znakowanych fluorescencyjnie patogenów do każdej komory z makrofagami. Dokładnie wymieszaj makrofagi z patogenami, pipetując próbkę w górę i w dół, uważając, aby nie dotknąć dna komory i nie naruszyć przywierających makrofagów. Włącz wszystkie komponenty konfokalnego mikroskopu z dyskiem rotującym.

Przygotuj mikroskop, nakładając olej na obiektyw imersyjny. Wsuń szkiełko z komorą do specjalistycznego stolika, a następnie zdejmij górną część komory i ustaw mikroskop do obrazowania DIC. Włącz migawkę pułapki optycznej oraz laser podczerwony (IR).

Następnie otwórz migawkę lasera prowadzącego do pułapki optycznej. Upewnij się, że migawka przed laserem IR jest zamknięta, sprawdzając to za pomocą karty IR. Teraz ustaw ostrość na makrofagach na przytwierdzeniu do szkiełka.

Następnie należy zlokalizować patogeny swobodnie pływające w roztworze w sąsiedztwie makrofagów. Najtrudniejszą częścią tej procedury jest znalezienie odpowiedniego obiektu do śledzenia w komorze próbki, co wynika z sił adhezji między obiektem a szkiełkiem nakrywkowym w komorze. Aby przesunąć dany obiekt, należy przesuwać stołem, podczas gdy obiekt jest utrzymywany przez laser pułapkujący; należy również pamiętać, że stół musi być przemieszczany z dostatecznie małą prędkością, aby siła oporu nie przekroczyła maksymalnej siły pułapkowania pułapki.

Przesuń stolik tak, aby patogen znajdował się w pobliżu pułapki. Następnie otwórz migawkę i aktywuj pułapkę. Przesuń próbkę, aby doprowadzić do kontaktu makrofagów z unieruchomionym w pułapce obrazem patogenu.

Patogeny za pomocą konfokalnego mikroskopu z wirującym dyskiem, w trybie DIC, fluorescencji lub kombinacji obu, oddzielne populacje Canada albicans, które mają zazwyczaj około pięciu mikronów wielkości, zostały oznakowane kolorami zielonym, niebieskim i czerwonym. Aby zilustrować obrazowanie, pojedyncza komórka C albicans została pochwycona i przesunięta po kwadracie przez skupisko innych drożdży, co wskazują szare strzałki, wykazując zdolność do przechwytywania i manipulowania konkretną lokalizacją pojedynczego patogenu wybranego przez operatora nawet w zatłoczonym środowisku. Aby dodatkowo zilustrować elastyczność tego systemu w pochwytywaniu różnych morfologii kształtów wykazywanych przez organizmy patogenne na tej rycinie, pęseta optyczna została użyta do utrzymania i usytuowania cząsteczki C albicans z pseudohifą.

Komórki C. albicans zostały oznakowane czerwonym barwnikiem i przemieszczone wzdłuż trajektorii zaznaczonej białą strzałką, a następnie umieszczone obok fluorescencyjnych surowych komórek GFPL C3 w kolorze zielonym. Część drożdżowa albicans została uwięziona, podczas gdy pseudohify ciągnęły się za nią.

Zarodnik Aspergillus fumigatus został również umieszczony obok surowej makrofagi mysiej, aby przeanalizować dokładny czas fagocytozy w przypadku tej konkretnej linii komórkowej i patogenu. Na tej rycinie obrazy w jasnym polu pokazują, w jaki sposób uwięziony Aspergillus, wskazany białą strzałką, został przemieszczony i ustawiony wzdłuż ścieżki wskazanej czerwoną strzałką. Uwięziony patogen znajduje się nieco poza zakresem ostrości, ponieważ pułapka wypchnęła organizm nieco powyżej płaszczyzny ogniskowej.

Grzyb Aspergillus był przemieszczany, aż znalazł się obok wybranej surowej komórki. W momencie nawiązania kontaktu patogenu z komórką pułapkę wyłączono. Następnie aktywowano proces fagocytozy i zastosowano obrazowanie poklatkowe w celu obserwacji kolejnych zdarzeń komórkowych.

W 30. sekundzie błona surowej komórki zaczęła ulegać zmianie i tworzyć wgłębienie wokół cząsteczki. W 60. sekundzie wgłębienie było w pełni uformowane. Od 90. do 150. sekundy Afu Gotti ulegał otaczaniu i pochłanianiu, a do 180. sekundy cząsteczka została całkowicie zinternalizowana.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak zbudować aparat do optycznej pułapki z wirującym dyskiem oraz w jaki sposób instrument ten pozwala na nieinwazyjne kontrolowanie patogenów w celu obrazowania żywych komórek po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie oddziaływań między gospodarzem a patogenem do zbadania roli relacji przestrzennych między komórkami gospodarza a patogenami oraz ich wpływu na następującą po nich odpowiedź immunologiczną.