Metoda mikroskopii bez użycia laserowej mikrodysekcji do mikrodysekcji dyskretnych obszarów mózgu myszy w celu izolacji całkowitego RNA oraz późniejszego sekwencjonowania następnej generacji i profilowania ekspresji genów

Ogólnym celem tej procedury jest izolacja całkowitego RNA z poszczególnych jąder mózgu w sposób powtarzalny, spójny, kosztowo efektywny i wolny od zanieczyszczeń RNazami. Cel ten osiąga się poprzez przygotowanie środowiska pracy wolnego od RNaz, a następnie wyjęcie całego mózgu z od decapitated myszy. Następnie, przy użyciu mikrometrycznego sekcjomierza do tkanek, wykonuje się seryjne przekroje tkankowe o jednolitej wielkości.

Następnie interesujące obszary mózgu poddaje się mikrosekcji przy użyciu rdzeni tkankowych o określonej średnicy, utrzymując tkankę w środowisku medium wolnym od RNA. Na koniec z wyciętych jąder mózgowia izoluje się całkowite RNA. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące wystarczającą wydajność i jakość całkowitego RNA do dalszego przygotowania biblioteki cDNA oraz profilowania transkryptomu za pomocą analiz spektrofotometrycznych lub fluorometrycznych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak makroskopowa anatomia lub wycinanie obszarów mózgu wspomagane mikroskopią laserową (laser capture microscopy), jest możliwość powtarzalnego i ekonomicznego pobrania wielu oddzielnych obszarów mózgu z jednego mózgu myszy. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki, na przykład czy odmienne profile ekspresji transkrypcyjnej w obszarach mózgu powiązanych z określonymi obwodami neuronalnymi mogą korelować z konkretnymi cechami behawioralnymi, odpowiedziami na czynniki środowiskowe lub stanem chorobowym. Aby przygotować się do mikrodyssekcji, do 100 ml zrównoważonego roztworu soli Earla (EBSS) należy dodać 0,44 g wodorowęglanu sodu oraz 0,884 g glukozy.

Potraktuj EBSS 0,1 mililitrów DEPC w autoklawowalnej butelce lub kolbie z nakrętką przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 37°C. Umieść szklane pipety o długości pięciu i trzy czwarte cala w jednolitrowym zlewce szklanym, a pędzle artystyczne z włosiem skierowanym do góry umieść w szklanym cylindrze miernym o pojemności 100 mililitrów.

Dodać odpowiednią ilość wody traktowanej DEPC, aby przykryć pipety i pędzle. Przykryć zlew i cylinder miarkowy folią aluminiową i inkubować przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 37 °C. Po 12-godzinnej inkubacji z DEPC poddać wszystkie materiały traktowane DEPC działaniu temperatury powyżej 100 °C przez co najmniej 15 minut. Schłodzić EBSS do temperatury pokojowej przed przechowywaniem w temperaturze 4 °C.

Wylej DD H2O z zlewki i cylindra miernego, a następnie kontynuuj inkubację w temperaturze powyżej 100 °C aż do całkowitego wyschnięcia materiałów. Wyjmij je z inkubatora, ostudź do temperatury pokojowej i przechowuj do późniejszego użycia. W dniu eksperymentu oczyść wszystkie powierzchnie robocze w celu usunięcia kontaminacji RNA, a EBSS umieść i utrzymuj w kąpieli wodnej ustawionej na 40 °C w celu buforowania i natlenienia.

Roztwór EBSS nasyca się 5% CO2 i 95% tlenem, umieszczając rurkę gazową w pipecie Pasteura wolnej od RNA. Po włożeniu pipety do EBSS należy zakryć otwór pojemnika z EBSS. Następnie należy przygotować slicer do seryjnego cięcia tkanki mózgowej.

Przetrzyj górną i dolną powierzchnię urządzenia do krojenia tkanek. Aby usunąć zanieczyszczenia RNA, przymocuj prostokątny kawałek papieru filtrującego Watman nr 4 do pleksiglasowej powierzchni urządzenia. Przymocuj dwukrawędziową żyletkę do ramienia urządzenia.

Ustaw mikrometr na zero i dostosuj minimalną wysokość ramienia siekacza tak, aby żyletka przecięła papier filtracyjny, ale nie płytkę z pleksiglasu. Przygotuj wszystkie dodatkowe materiały niezbędne do mikrodysekcji, w tym wolne od RNA szalki hodowlane o wymiarach 60 by 15 milimetrów, 200 µL końcówki do mikropipet wolne od RNA, zakrzywione nożyczki, suchy lód oraz probówki do pobierania tkanek. Umieść probówki na suchym lodzie po zdekapitowaniu myszy za pomocą gilotyny dla gryzoni i usunięciu całego mózgu z nienaruszonymi nerwami wzrokowymi oraz strukturami rombencefalu.

Umieść mózg w górnej części sterylnej szalki hodowlanej do komórek o wymiarach 60 na 15 mm, wolnej od RNaz. Następnie przenieś ją na powierzchnię roboczą do pobierania próbek tkanek. Używając pipety wolnej od RNaz, ostrożnie zwilż papier filtracyjny przymocowany do rozdrabniacza tkanek roztworem EBSS.

Nawilż tkankę mózgu roztworem EBSS. Przenieś mózg do przecinarki tkankowej i ułóż go tak, aby powierzchnia brzuszna spoczywała na papierze filtracyjnym. Linia środkowa powinna być prostopadła do ostrza przecinarki, a krawędź rostralna mózgu powinna przylegać do ostrza.

Użyj pędzla artystycznego potraktowanego A-D-E-P-C, aby unieruchomić mózg, przykładając delikatny nacisk do jego powierzchni grzbietowej. Podnieś dźwignię uchwytu ostrza na wysokość około czterech do pięciu centymetrów nad powierzchnią tkanki grzbietowej i utrzymaj ją w tej pozycji. Zdejmij pędzel z powierzchni mózgu i ustaw wartość 750 micrometers.

Użycie mikrometru. Należy opuścić dźwignię, aby przeciąć tkankę i utworzyć 750 µm przekrój czołowy, podczas gdy ostrze sekcjomatu pozostaje w spoczynku. Przy użyciu pędzla artystycznego, wykonując ruch obrotowy, należy delikatnie odsunąć przekrój tkanki od powierzchni ostrza.

Natychmiast umieść przekrój tkanki w natlenionym EBSS w szalce Petriego. Przekrój ten jest teraz gotowy do mikrodysekcji. Powtarzaj procedurę krojenia, aż do uzyskania seryjnych przekrojów mózgu w całej płaszczyźnie rostralno-kaudalnej w celu przeprowadzenia mikrodysekcji.

Najpierw należy sprawdzić oświetlenie, aby upewnić się, że iluminacja próbki nie będzie utrudniona. Dostosuj położenie i przepływ mieszaniny O2 i CO2, aby utrzymać buforowane, natlenione środowisko dla tkanki. W trakcie procedury zidentyfikuj coronalny przekrój mózgu zawierający badany obszar i za pomocą pędzla artystycznego ułóż go płasko na dnie szalki Petriego.

Wybierz wycinak do tkanek o odpowiedniej średnicy. Przytrzymaj koronalny przekrój tkanki za pomocą pędzla artystycznego i opuść ostrze wycinaka na powierzchnię przekroju. Wywierając nacisk, przebij końcówką wycinaka przekrój tkanki, dociskając go mocno do dna szalki Petriego.

Stosując kolisty ruch toczenia, upewnij się, że obszar zainteresowania został oddzielony od otaczającej tkanki. Ostrożnie unieś rdzeń tkanki z przekroju i uwolnij mikro-wycinek, pozwalając mu swobodnie pływać w EBSS, używając do tego pędzla artystycznego. Natychmiast przenieś mikro-wycinek tkanki do probówki do stabilnego przechowywania w temperaturze -80 °C, umieszczonej na suchym lodzie.

Tkanka powinna łatwo przylegać do ścianki probówki. Przenieś probówkę zawierającą próbkę mikrodysekcyjną z powrotem do suchego lodu. Powtórz tę mikrodysekcję dla każdego interesującego obszaru mózgu.

Po zakończeniu mikrodysekcji zapisz odpowiednią etykietę lub kody kreskowe dla każdej probówki zawierającej próbkę. Umieść próbki tkanek w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA z próbek tkankowych. W pierwszej kolejności przygotuj wolną od RNA przestrzeń roboczą.

Przygotować odpowiednią ilość mieszaniny kulek magnetycznych oraz roztworu wiążąco-lizującego zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu do izolacji całkowitego RNA. Wyjąć próbki tkanek z zamrażarki ustawionej na -80 °C i umieścić probówki bezpośrednio na suchym lodzie. Do probówki z próbką dodać 100 µL roztworu wiążąco-lizującego.

Do mieszalnika do peletów przymocuj tłuczek dopasowany do probówek o pojemności 0,5 ml i zhomogenizuj tkankę, używając końcówki do pipety wolnej od nukleaz o niskiej retencji. Natychmiast przenieś zhomogenizowaną próbkę do dołka okrągłego 96-dołkowego płytki do hodowli tkankowej, używając tego samego typu końcówki. Do próbki dodaj 60 µL 100% izopropanolu.

Dodaj 20 µL mieszaniny kulek do próbki i wymieszaj, pipetując ciecz w górę i w dół trzy do czterech razy. Postępuj zgodnie z krokami protokołu zestawu do izolacji całkowitego RNA, aby zakończyć ekstrakcję całkowitego RNA. Na koniec zmierz czystość i stężenie otrzymanego całkowitego RNA. Dane dotyczące całkowitego RNA z mikrobiopsji różnych obszarów mózgu przedstawiono w tej tabeli.

Próbki RNA eluowane 30 µL buforu do elucji dostarczyły wystarczającą ilość całkowitego RNA do zastosowania z komercyjnie dostępnymi zestawami do przygotowania cDNA do sekwencjonowania RNA. Ponadto wydajność RNA oraz wartości stosunku 260 do 280 są pojedynczymi wartościami uzyskanymi z odpowiednich próbek po mikrodissekcji, aby zademonstrować odczyty z każdego regionu mózgu, co potwierdza wysoką czystość próbek. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje od 8 do 10 minut. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zminimalizowanie ryzyka kontaminacji RNA powierzchni roboczych lub próbek tkanek poprzez stosowanie wyłącznie materiałów wolnych od RNazy lub traktowanych DEPC.