Śledzenie deformacji tkankowych w procesach morfogenetycznych we wczesnym zarodku kurczaka

Ogólnym celem przedstawionych tutaj technik jest znakowanie i hodowla tkanek embrionalnych w celu pomiaru deformacji morfogenetycznych podczas wczesnego rozwoju. W przypadku hodowli wczesnego zarodka kurczaka, należy rozpocząć od usunięcia zarodka z jaja przy użyciu metody przenoszenia na papierze filtracyjnym. W zależności od zastosowania eksperymentalnego, należy oznakować wyizolowany zarodek fluorescencyjnymi barwnikami lipofilowymi dostarczanymi za pomocą magnetycznych cząstek żelaza lub mikrosferami polistyrenowymi. Następnie należy śledzić znaczniki podczas hodowli, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną lub obrazowanie metodą optycznej koherencyjnej tomografii.

Obrazowanie wynikających z tego map odkształceń morfogenetycznych wskazuje obszary wydłużania, skracania i ścinania tkanki w dwóch i trzech wymiarach. Cześć, nazywam się Ben Philis i jestem doktorantem w laboratorium dr. Larry'ego Tabora w Katedrze Inżynierii Biomedycznej na Washington University in St.Louis. Przed rozpoczęciem tego typu eksperymentów ważne jest rozważenie odpowiednich technik hodowli tkanek w systemie modelowym, dostępnych metod obrazowania, a także rodzaju danych, które chcą Państwo uzyskać z przeprowadzonych badań.

Na przykład, czy interesuje Państwa analiza deformacji tkanek w dwóch lub trzech wymiarach? Odpowiemy na niektóre z tych pytań, prezentując dwie komplementarne techniki znakowania we wczesnym zarodku kurczaka. Witam, nazywam się Victor Varner i pracuję w laboratorium dr. Larry'ego Tabora na Washington University w St. Louis.

W obu tych technikach szybko i jednocześnie znakujemy setki komórek we wczesnym zarodku kurczaka. Śledzenie ruchu tych znaczników pozwala nam nie tylko określić tkanki, w których komórki te ostatecznie się osiedlają, ale także ilościowo ocenić deformacje na poziomie tkankowym, które kształtują wczesny zarodek. Najpierw inkubuj jaja w orientacji podłużnej do pożądanego stadium zgodnie z klasyfikacją Hamburgera i Hamiltona.

Rozbij dno jaja o krawędź szalki Petriego o średnicy 150 milimetrów. Odsuń skorupkę od dna, przelej zawartość jaja do szalki, a następnie za pomocą pęsety tępowej usuń gęstsze, lepkie białko z żółtka. Następnie wykonaj otwory w środku okrągłego papieru filtracyjnego.

Umieść jeden z pierścieni z papieru filtracyjnego na żółtku w taki sposób, aby embrion był widoczny przez centralny otwór pierścienia. Przytnij zewnętrzny obrys pierścienia z papieru filtracyjnego za pomocą mikronozyczek. Następnie usuń papier z przytwierdzonym embrionem z żółtka za pomocą precyzyjnych pincet i delikatnie zanurz embrion w kąpieli z PBS. Aby usunąć przylegające cząsteczki żółtka, przenieś zespół z papierem filtracyjnym do 35 milimetrowej szalki hodowlanej.

Kładąc go stroną brzuszna do góry, zabezpiecz zarodek drugim pierścieniem z papieru filtracyjnego. Przymocuj go metalowym pierścieniem i zanurz zarodek w pożywce hodowlanej. Jeśli zarodek nie zostanie całkowicie zanurzony, geometria tkanki i późniejsza morfogeneza mogą ulec znacznym zmianom z powodu nienaturalnie wysokiego napięcia powierzchniowego.

Podczas hodowli, używając mikroskopu w polu jasnym, należy zweryfikować prawidłową morfologię oraz stadium embrionalne. Najpierw pobierz niewielką ilość proszku żelaznego, dodaj kilka kropel nasyconego barwnika i alkoholu, a następnie wysusz na powietrzu za pomocą końcówki dociągniętej mikropipety. Rozbij skupione cząsteczki żelaza i przenieś je do probówki do mikrocentryfugi.

Po kilkukrotnym płukaniu wodą zjonizowaną, zebrany embrion umieść grzbietem do góry w 35 milimetrowej szalce hodowlanej, pokrytej obfitą warstwą pożywki. Pod mikroskopem stereotypowym, za pomocą szklanej igły, usuń błonę vilin i odsłoń komórki elektrodermalne. Następnie nabierz kolumnę znakowanych cząsteczek żelaza do pipety Pasteura.

Używając mikroskopu stereoskopowego, zanurz pipetę tak, aby znajdowała się tuż nad embrionem. Powoli przesuwaj pipetę przód-tył między opuszkami palców, aby rozprowadzić cząsteczki na embrionie. Po 10 minutach inkubacji w temperaturze 37 °C usuń cząsteczki za pomocą silnego magnesu.

W razie potrzeby przymocuj magnes do precyzyjnej pęsety magnetycznej i za pomocą namagnesowanej pęsety ostrożnie usuń wszelkie pozostałe cząsteczki żelaza. Następnie wykonaj obrazy zarodka w jasnym polu oraz w fluorescencji. Używając igły o rozmiarze 22 G.

Naciągnij roztwór czarnych mikrosfer o średnicy 10 µm w PBS do strzykawki o pojemności 10 cc. Następnie ścinij końcówki wyciągniętych szklanych igieł, używając dysku twardego komputera, i napełnij je roztworem kulek. Delikatnie stuknij mikropipetę, aby roztwór dotarł do końcówki, posługując się mikromanipulatorem.

Umieścić szklaną igłę w tym samym polu widzenia co embrion. Potwierdzić wypływ kulek z końcówki pipety. Następnie wprowadzić końcówkę pipety do światła rurki mózgowej.

Należy uważać, aby nie przebić brzusznej ściany tkanki. Monitoruj przejściowe obrzęki tkanki w momencie wprowadzania kulek i płynu do światła naczynia. Następnie szybko wyjmij szklaną igłę.

Na koniec należy zweryfikować, czy w wewnętrznym świetle rurki mózgowej uzyskano wystarczającą gęstość kulek. Przy użyciu mikroskopu w świetle przechodzącym należy odczekać od 20 do 30 minut, aż kulki opadną, przed wykonaniem obrazów w świetle przechodzącym lub zestawu danych optycznej tomografii koherentnej. Po wykonaniu pierwszych obrazów należy umieścić do 7 szalek hodowlanych o średnicy 35 mm z próbkami w szalce Petriego o średnicy 150 mm, a następnie całe zestaw umieścić w małej plastikowej torebce.

Do worka dodaj krople wody dejonizowanej w celu nawilżenia, a następnie napełnij worek mieszaniną 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Umieść zarodki w inkubatorze o temperaturze 37°C do czasu kolejnego punktu czasowego obrazowania. Przenieś oznakowane zarodki do szalki delta T zawierającej 1,2 ml pożywki hodowlanej i przykryj szalkę szklaną pokrywką utrzymywaną w temperaturze 37°C. Przeprowadzaj superfuzję zarodka mieszaniną gazów 95% O2 i 5% CO2 dostarczaną z urządzenia do regulacji przepływu typu minipompa. Następnie skonfiguruj oprogramowanie do automatycznego pozyskiwania obrazów w wybranych odstępach czasu.

W trakcie eksperymentu znaczniki mogą być śledzone automatycznie lub ręcznie, a dla współrzędnych markerów można obliczyć mapy odkształceń morfogenetycznych. W niniejszym przypadku zastosowano technikę cząsteczek żelaza w celu oznakowania i śledzenia ruchu komórek elektrodermalnych podczas formowania się fałdu głowy. Wczesny embrion kurczaka został wypełniony fluorescencyjnie oznakowanymi komórkami, które rozmieszczono w całym embrionie.

Obrazy zarodka w jasnym polu i fluorescencyjne wykonano w różnych odstępach czasu podczas hodowli ex ovo. Służyło to monitorowaniu ruchów markerów traktu. Skumulowane dane pozwalają na obliczenie ewoluujących rozkładów odkształceń morfogenetycznych podczas formowania się fałdu głowowego.

Podobnie, technika z użyciem polistyrenowych mikrosfer została wykorzystana do śledzenia ruchów tkanek na granicy środkowej i tylnej części mózgu wczesnego zarodka kurczaka. Należy zauważyć, że metoda ta pozwala na analizę wyraźnych odkształceń 3D, ponieważ kule mają tendencję do przylegania do wszystkich ścian wewnętrznego światła mózgu. Po śledzeniu ruchu kulek przez sześć godzin, współrzędne markerów umożliwiają obliczenie odkształceń, co pozwala na charakterystykę deformacji tkanek w kierunku podłużnym i obwodowym.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiąść wiedzę na temat niektórych kroków eksperymentalnych niezbędnych do przeprowadzenia własnej hodowli i znakowania tkanek. Przedstawione tutaj techniki protokołu są szczególnie korzystne, ponieważ są one minimalnie inwazyjne dla tkanek rodzimych, a ponadto wykorzystują niedrogie i łatwo dostępne materiały. Eksperymenty te są szczególnie użyteczne w badaniach nad mechaniką rozwoju embrionalnego.

Ponieważ pola deformacji obliczone na podstawie śledzenia ruchu znakowanych komórek mogą służyć zarówno do testowania, jak i konstruowania fizycznych modeli morfogenezy.