Profilowanie ekspresji mRNA napięciowo zależnych kanałów potasowych w neuronach istoty czarnej z wykorzystaniem technik jedno-komórkowego RT-PCR

Ogólnym celem tej procedury jest wykrywanie mRNA w poszczególnych neuronach. Osiąga się to poprzez metodę patch-clamp i rejestrację pojedynczych neuronów, a następnie całkowite odessanie cytoplazmy z każdego zarejestrowanego neuronu w celu wyodrębnienia mRNA. Następnie z cytoplazmy przygotowuje się cDNA, które jest powielane metodą PCR.

Ostatecznie, specyficzne mRNA dla receptorów, kanałów jonowych i enzymów można wykryć za pomocą konwencjonalnego systemu obrazowania żeli. Nazywam się, pracuję w University of Tennessee Health Science Center. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ ilość mRNA w pojedynczym neuronie jest niezwykle mała i łatwo ją utracić.

Protokół należy rozpocząć od użycia wibrotomu do wycięcia koronarnych skrawków mózgu o grubości 300 µm, zawierających środkową część rostralną istoty czarnej. Mózgi można pobrać od szczurów rasy Sprague Dawley w wieku od 15 do 40 dni. Procedurę krojenia skrawków przeprowadza się w temperaturze lodowej w wysokostężonym roztworze sacharozy, natlenionym mieszanką 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla, przy pH 7,4; skrawki należy inkubować w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym napowietrzonym mieszanką gazów 5% dwutlenku węgla i 95% tlenu.

Utrzymuj temperaturę 34 °C i pozostaw plastry na 45 minut. Następnie przechowuj plastry mózgu w temperaturze pokojowej do momentu rejestracji. Rozpocznij od przeniesienia jednego plastra mózgu do komory rejestracyjnej patch clamp.

W sposób ciągły perfundowano natlenionym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym w temperaturze 32 °C. Pipety do aplikacji (patch pipettes) napełniono autoklawowanym roztworem wewnątrzkomórkowym przygotowanym w wodzie wolnej od DNA i RNA. Napełnioną pipetę wprowadzono do kąpieli.

Sprawdź, czy rezystancja wynosi od dwóch do trzech megaomów. Najpierw zlokalizuj istotną czerń (substantia nigra), kierując się jej charakterystycznym położeniem anatomicznym. Następnie, korzystając z optyki Namar i obiektywu 60 x, wybierz duże komórki w obszarach SNC i SNR do rejestracji.

Są to bez wątpienia neurony dopaminergiczne lub GABAergiczne. Należy zastosować konwencjonalną konfigurację whole-cell z gigaomowym uszczelnieniem (giga seal), aby przeprowadzić pomiary w trybie clamp prądowy oraz clamp napięciowy. Rejestracje te powinny być zazwyczaj wykonane w czasie krótszym niż pięć minut, aby zminimalizować degradację mRNA.

W ciągu około minuty możliwe jest stworzenie elektrofizjologicznych odcisków palca dla wybranych neuronów poprzez rejestrację wyłącznie ich właściwości błonowych oraz charakterystyki potencjałów czynnościowych. Po uzyskaniu danych z wybranego neuronu należy delikatnie odessać cytoplazmę za pomocą ssania ustnego. Szczelna blokada nie powinna zostać przerwana, w przeciwnym razie.

Pozakomórkowe zanieczyszczenia, w tym mRNA, mogą zostać zaciągnięte do pipety patchowej i zanieczyścić zawartość komórki. Wypchnij zawartość komórki do probówki PCR o pojemności 0,2 mililitra, łamiąc końcówkę pipety i przykładając lekkie ciśnienie dodatnie. Po zakończeniu natychmiast umieść probówkę w zamrażarce o temperaturze -20°C, aby wykluczyć kontaminację pozakomórkowymi zanieczyszczeniami, które mogą zawierać mRNA.

Przygotuj kontrolę negatywną, zbierając zawartość pipety patch opuszczonej do tkanki bez wykonywania aspiracji. Po zebraniu zawartości komórkowej z 10 do 20 neuronów niezwłocznie rozpocznij reakcję odwrotnej transkrypcji. Aby zminimalizować degradację mRNA, zacznij od trawienia ewentualnego zanieczyszczonego DNA genomowego za pomocą DNazy przez pięć minut w temperaturze 25 °C.

Ten etap jest krytyczny w celu zminimalizowania ryzyka wyników fałszywie dodatnich i nie należy go pomijać. Następnie należy inaktywować DNA, dodając 1,2 µL 25 mM EDTA, a próbki inkubować w temperaturze 70 °C przez pięć minut. Teraz, przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu, należy zsyntetyzować CD NA, aby zweryfikować, czy DNA genomowe zostało całkowicie usunięte.

Przeprowadź reakcję kontrolną dla każdej próbki bez odwrotnej transkryptazy, zachowując wszystkie pozostałe składniki reakcji bez zmian. Produkty przechowuj w temperaturze -20 °C do czasu ich wykorzystania w procedurze PCR.

Startery zgodnie z sekwencjami w Gen bank, o ile to możliwe, należy zaprojektować tak, aby obejmowały miejsce połączenia intronu z eksonem, co ułatwi wykrycie kontaminacji DNA genomicznego. Aby sprawdzić skuteczność par starterów, należy w pierwszym etapie przetestować je na cDNA z całego mózgu. 5 µL z 30 µL cDNA poddać amplifikacji PCR przez 35 cykli, stosując standardowy protokół cykli termicznych.

W drugim etapie należy przeprowadzić amplifikację PCR 1 µL produktu PCR z pierwszego etapu, używając tych samych starterów oraz lekko zmodyfikowanego profilu cykli. Następnie produkty należy rozdzielić na żelu AGROS 2,5% i zwizualizować z użyciem bromku etydium lub GelGreen. Pod wpływem światła UV należy wyciąć pasma dodatniego DNA, a następnie przeprowadzić sekwencjonowanie z wykorzystaniem dostępnego komercyjnie zestawu do izolacji DNA.

Porównano charakterystyki elektrofizjologiczne neuronów w istocie czarnej, części zwartej oraz części siateczkowatej. Neurony GABAergiczne SNR wykazywały częstotliwość wyższych, spontanicznych wyładowań o częstotliwości około 10 hertz. Wyładowania te miały podstawową czas trwania około jednej milisekundy po wstrzyknięciu prądu hiperpolaryzującego.

Neurony GABAergiczne SNR wykazały subtelną odpowiedź SAG, co wskazuje na słabo aktywowany prąd. W przeciwieństwie do nich, nigralne neurony dopaminergiczne wykazywały niskoczęstotliwościowe spontaniczne kolce o czasie trwania bazy około trzech milisekund. Neurony dopaminergiczne wykazały również wyraźny SAG w odpowiedzi na hiperpolaryzację, co wskazuje na silną ekspresję prądu IH w neuronach GABAergicznych SNR, ale nie w neuronach dopaminergicznych.

Metoda Single cell R-T-P-C-R wykryła mRNA dladekarboksylazy kwasu glutaminowego 1, kluczowego enzymu w syntezie GABA. W przeciwieństwie do tego, zidentyfikowano neurony dopaminergiczne w SNC i SNR, ale nie w neuronach GABAergicznych. Metoda Single cell R-T-P-C-R wykryła mRNA dla hydroksylazy tyrozynowej, kluczowego enzymu w syntezie dopaminy.

Następnie zastosowano metodę jednokomórkowej RT-PCR w celu profilowania ekspresji podjednostek kanałów KV3 aktywowanych napięciem, które modyfikują właściwości napięciowo zależnych kanałów potasowych. W przykładzie SNR gaba, mRNA dla KV 3.1, 3.2, 3.3 i 3.4 wykryto wyłącznie w przykładowym neuronie S-N-R-D-A. KV 3.2, 3.3 i 3.4 wykryto w danych zbiorczych.

Kanał KV 3.1 wykryto częściej w neuronach GABAergicznych SNR niż w neuronach dopaminergicznych prążkowia, co wskazuje na wyższy poziom ekspresji KV 3.1 w szybkich neuronach GABA SNR. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o założeniu rękawiczek i utrzymaniu narzędzi w czystości po zakończeniu prac. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny neuronauki do zgłębiania ekspresji i funkcji receptorów oraz kanałów jonowych w układzie nerwowym.