Izolacja & Charakterystyka barwnika Hoechst^niski CD45^ujemny Mezenchymalne komórki macierzyste płuc myszy

Niniejszy film prezentuje protokół izolacji gospodarczych mezenchymalnych komórek macierzystych płuc o niskiej ekspresji CD 45 (CD 45-). Tkankowe mezenchymalne komórki macierzyste, lub MSC, są istotnymi regulatorami naprawy lub regeneracji tkanek, włóknienia, stanu zapalnego oraz angiogenezy. W pierwszej kolejności płuca zostają wypreparowane z uśpionej myszy.

Tkanka płucna zostaje poddana trawieniu w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Komórki są barwione barwnikiem żywotności oraz przeciwciałami anty-CD 45, a następnie poddane sortowaniu metodą cytometrii przepływowej w celu wyizolowania CD 45-ujemnych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) płuc gospodarza. Następnie MSC płuc są namnażane w hodowli, a w celu oceny ich zdolności do różnicowania przeprowadzany jest test tworzenia kolonii.

Następnie można przeprowadzić dalsze badania w celu sprawdzenia roli MSC w homeostazie tkanek oraz w przebiegu chorób. Przedstawiona tutaj metoda może być wykorzystana do izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych płuc myszy lub człowieka i może zostać zastosowana w badaniach nad chorobami płuc, takimi jak włóknienie płuc, nadciśnienie płucne oraz POChP. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności ze względu na różnorodność dostępnych metod przygotowania tkanek, a także kwestie konfiguracji cytometru przepływowego, doboru odpowiednich kontroli i analizy danych.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ trudno jest opisać za pomocą samych słów właściwą technikę siekania i trawienia tkanki płucnej w celu uzyskania optymalnej żywotności komórek. Ponadto konfiguracja urządzenia do cytometrii przepływowej oraz analiza danych są najlepiej przekazywane poprzez demonstrację. Rozpocznij ten protokół od usunięcia płuc, które zostaną wykorzystane do pozyskania mezenchymalnych komórek macierzystych, z uśmierconej dorosłej myszy.

Za pomocą małych, ostrych nożyczek należy przeciąć klatkę piersiową myszy bocznie po każdej stronie. Po otwarciu jamy klatki piersiowej należy usunąć przeponę. Do prawej komory serca wprowadzić strzykawkę o pojemności 10 ml z igłą o rozmiarze 20,5 gauge i delikatnie nacisnąć tłok, aby przepłukać ją 3–5 ml PBS, usuwając krew z płuc.

Następnie za pomocą nożyczek odetnij tchawicę i główny oskrzele i je usuń. Następnie używając pęsety, pobierz małe białe płaty płuc i umieść je w szalce Petriego wypełnionej zbuforowanym roztworem soli Hanksa lub HBSS.

Następnie usuń serce i oddziel płaty płuc. Powtórz tę procedurę u wszystkich myszy biorących udział w badaniu. Przenieś płaty płuc na pokrywkę naczynia.

Nawilż tkankę niewielką ilością HBSS, aby zapobiec jej wysychaniu. Następnie, używając jednorazowego skalpela, posiekaj płaty płuc, aby uzyskać szpik kostny do wykorzystania jako kontrola dodatnia w cytometrii przepływowej. Użyj ostrych nożyczek, aby przeciąć tkankę w okolicy kostki oraz górnej części kości udowej.

Umieść kończynę w nowej szalce Petriego. Następnie odetnij kolano, pozostawiając liniowy fragment kości udowej oraz drugi fragment zawierający kość piszczelową i strzałkową. Za pomocą pęsety usuń mięśnie, aby odsłonić kość piszczelową, strzałkową i udową.

Następnie należy wziąć strzykawkę o pojemności 5 ml z igłą o rozmiarze 26,5 G i wprowadzić igłę do otworu szpiku kostnego. Trzymając kość za jeden koniec piszczeli, należy skierować drugi koniec do probówki stożkowej o pojemności 50 ml wypełnionej 15 ml HBSS, a następnie nacisnąć tłok, aby podać HBSS i wypłukać szpik kostny do probówki. Proces ten należy powtórzyć dla kości strzałkowej oraz udowej.

Zbarw szpik kostny barwnikiem host 3 3 3 4 2 w końcowym stężeniu 5 µg/mL w suplementowanym DMEM z wysoką zawartością glukozy. Następnie z wyizolowanej tkanki płuc zostanie przygotowana zawiesina pojedynczych komórek. Umieść każde płuco w probówce zawierającej podgrzany 0,2% Worthington.

Kollagenazę typu dwa przygotowano w sterylnym roztworze HBSS, następnie probówkę zanurzono w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubowano przez 30 minut. Po inkubacji, za pomocą pipety 10 ml, homogenizowano próbkę przez triturację do momentu, aż materiał trawiony będzie swobodnie przepływał przez pipetę. Powtórzono tę czynność około 10 razy, a następnie inkubowano przez dodatkowe 15 minut w temperaturze 37 °C, aby całkowicie strawić tkankę.

Po zakończeniu trawienia rozcieńczyć zawiesinę komórkową za pomocą HBSS i ponownie użyć pipety pięciomililitrowej, aby rozbić wszelkie pozostałe fragmenty tkanki. Następnie, w celu usunięcia nietrawionych fragmentów tkanki, przelać zawiesinę przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Zawiesinę należy dodawać małymi porcjami, aby próbka mogła swobodnie przepłynąć przez sitko komórkowe.

Jeśli nieprzetrawione fragmenty tkanek całkowicie zablokują przepływ zawiesiny komórkowej, należy przelać ją przez nowy sitko komórkowe do nowej probówki. Zawiesinę komórkową należy odwirować przez 10 minut przy 450 RCF.

Po wirowaniu odlej nadsącz i delikatnie zawieś osad komórkowy w buforze do lizy erytrocytów w temperaturze pokojowej, inkubując przez pięć minut. Następnie dodaj taką samą objętość HBSS, aby dezaktywować bufor do lizy.

Przelej zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe o rozmiarze oczek 40 µm w celu usunięcia zanieczyszczeń i agregatów komórkowych, zbierając przefiltrowany materiał do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Następnie, używając komory licznikowej (hemocytometru), wyznacz liczbę komórek dla próbek z płuc oraz szpiku kostnego. Zapisz stężenie i całkowitą objętość zawiesiny komórkowej.

Następnie odwiruj zawiesinę pojedynczych komórek płuc przy 450 RCF przez 10 minut, aby uzyskać osad. W celu podtrzymania żywotności komórek, resuspenduj jednocześnie komórki płuc i szpiku kostnego w stężeniu 10⁶ komórek/ml w uprzednio ogrzanym, uzupełnionym wysokoglukozowym DMEM.

Aby zabarwić DNA, należy dodać barwnik HOAXED 3 3 3 4 2 do stężenia końcowego 5 µg/L. Następnie komórki należy wymieszać przez delikatne odwracanie probówek i inkubować w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez dokładnie 90 minut. Po tym czasie należy odwirować próbki przez 10 minut przy 450 ×g w temperaturze 4 °C.

Przejdź do barwienia tkanki płuc i szpiku kostnego przeciwciałem anty-CD 45 oraz jodkiem propidyny w ramach przygotowania do analizy metodą cytometrii przepływowej. Po zabarwieniu komórek przechowuj probówki w lodzie, chroniąc je przed światłem, aż do momentu przeprowadzenia analizy cytometrycznej. Przygotuj aparat do cytometrii przepływowej, upewniając się, że lasery instrumentu są skalibrowane, a urządzenie jest ustawione do sortowania komórek.

Użyte urządzenie musi być wyposażone w lasery: niebieski 488 nanometr, czerwony 635 nanometr oraz UV 350 do 355 nanometr, z dwoma detektorami na drodze wiązki lasera UV z filtrami niebieskim 45 over 65 i czerwonym 6 75 over 50. Dodatkowo detektor UV czerwony musi charakteryzować się wysoką czułością na sygnał czerwony, a urządzenie musi być wyposażone w chłodziarkę w celu utrzymania próbki w temperaturze 10 stopni Celsjusza. W oprogramowaniu urządzenia należy skonfigurować wykresy histogramów w celu wyświetlenia liniowego rozproszenia przedniego (forward scatter) względem bocznego (side scatter) oraz wykres dyskryminacji dubletów odpowiedni dla danego instrumentu.

Wykres histogramu dla PI z użyciem sygnału logarytmicznego, wykres czerwony przeciwko niebieskiemu z użyciem sygnałów liniowych oraz wykres histogramu dla CD 45 A PC z użyciem sygnału logarytmicznego. Gdy instrument będzie gotowy, umieść zbarwioną próbkę szpiku kostnego w porcie załadowczym urządzenia. Próbka ta służy jako kontrola barwienia oraz kalibracji instrumentu.

Rozpocznij zbieranie zdarzeń i dostosuj liniowe sygnały rozproszenia przedniego (forward scatter) oraz rozproszenia bocznego (side scatter). Aby wyraźnie zwizualizować populację komórek, powinny one znajdować się mniej więcej w dolnej środkowej części wykresu, gdzie rozproszenie przednie stanowi oś x. Ponieważ barwnik jądrowy PI przenika przez błonę komórkową, będzie on wykluczony z komórek żywych.

Wyznacz obszar bramkowania dla martwych komórek wykazujących pozytywny sygnał PI na histogramie PI. W oprogramowaniu urządzenia ustaw kolor czerwony dla komórek znajdujących się w tej bramce.

Pomocne jest wykorzystanie zabarwionych na kolor martwych komórek jako punktu orientacyjnego do zidentyfikowania populacji G0/G1 gospodarza. Barwnik PI jest również wzbudzany przez laser UV i większość martwych komórek powinna znajdować się poza skalą. Po prawej stronie wykresu fluorescencji czerwonej względem niebieskiej gospodarza, populacja G0/G1 szpiku kostnego powinna być widoczna jako gęsty skupiony zbiór zdarzeń na wykresie fluorescencji czerwonej względem niebieskiej gospodarza.

Dostosuj napięcia detektorów tak, aby klaster G0/G1 znajdował się w górnej prawej części środka wykresu. Część fazy S oraz cała faza G2 cyklu komórkowego mogą wykraczać poza skalę. W prawym górnym rogu wykresu red versus blue, populacja boczna (side population) będzie widoczna jako ślad ciągnący się od lewej strony klastra G0/G1 w dół, do lewego dolnego rogu wykresu.

Następnie wyznacz bramkę wokół skupiska komórek na wykresie FSC względem SSC. Wyznacz populację singletów zidentyfikowaną na wykresie dubletów oraz żywe komórki na histogramie PI. Następnie przypisz wykres hoax tak, aby wyświetlał tylko te wyselekcjonowane populacje.

Po wyznaczeniu bramkowania na wykresie głównym, obrysuj obszar wokół populacji bocznej (side population). Przypisz ten obszar jako bramkę do histogramu CD 45 A PC wraz z bramkami dla singletów rozpraszania światła oraz żywych komórek. Po skonfigurowaniu systemu wyjmij próbkę z portu załadowczego i umieść w nim próbkę płuca.

Ustawienia instrumentu nie powinny wymagać ponownej korekty dla tej próbki. Rozpocznij zbieranie zdarzeń na wykresie hoax czerwony kontra niebieski. Grupa G zero G one dla próbki płuca zazwyczaj wydaje się bardziej wydłużona wzdłuż osi x i przypomina symbol tyldy na klawiaturze.

Bramka dla populacji bocznej (side population) powinna znajdować się w pozycji zbliżonej do tej ustawionej dla próbki szpiku kostnego. Niezbędne mogą być niewielkie korekty w górę lub w dół, aby zapewnić wysoką rozdzielczość populacji bocznej. Podczas sortowania należy utrzymać niską różnicę ciśnień, upewniając się, że zawór przepływu próbki nie jest zbyt szeroko otwarty.

Aby wyizolować MSC, należy umieścić płytkę kolekcjonacyjną z 96 dołkami w komorze sortowania, a następnie ustawić bramki sortowania na histogramie CD 45 A PC, aby oddzielić populację pozytywną od negatywnej. Na koniec należy zebrać komórki albo jako populację mieszaną do probówki, albo jako pojedyncze komórki do płytki 96-dołkowej w celu izolacji klonów. Po zebraniu MSC z płuc metodą sortowania komórek, komórki wysiewa się do naczyń 30 mm, stosując pożywkę A MEM uzupełnioną o 20% FBS. Początkowo posortowane komórki wydają się małe, okrągłe i jasne; proces ten trwa około dwóch do trzech tygodni.

Kolonie o fenotypie mezenchymalnym stają się widoczne, a proliferacja jest bardziej wyraźna dla każdej preparacji komórkowej. Oceń zdolność MSC z płuc do różnicowania się w tradycyjne linie mezenchymalne osteoblastów, adipocytów i chondrocytów oraz ekspresję przyjętych markerów mezenchymalnych na ich powierzchni komórkowej. Przeprowadź analizę pasmowania cytogenetycznego, aby potwierdzić brak poważnych nieprawidłowości chromosomowych.

Po izolacji metodą cytometrii przepływowej i wygenerowaniu klonów pojedynczych komórek, przeprowadza się test tworzenia kolonii w celu scharakteryzowania komórek MSC oraz ich zdolności do różnicowania. Należy rozpocząć od komórek rozcieńczonych do stężenia 3 × 10⁴ komórek na mililitr. W szalkach 100 mm z niepełną pożywką kul, wykonuje się rozcieńczenia seryjne: 2,6 × 10⁴, 3 × 10⁴, 1,5 × 10⁴ oraz 0,75 × 10⁴ komórek na szalkę w 10 ml pożywki, w trzech powtórzeniach.

Następnie, po 10 dniach hodowli, umieść płytki w inkubatorze, odlej pożywkę i wypłucz komórki za pomocą PBS. Następnie utrwal je, dodając 100% methanol przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach odlej methanol.

Następnie, aby wykryć tworzenie kolonii, należy dodać 0,4% w/v gza rozcieńczonego w wodzie zjonizowanej w stosunku 1:20 i inkubować przez 10 do 15 minut. Następnie zlać barwnik i wypłukać wodą zjonizowaną. Pozostawić próbki do wyschnięcia na powietrzu, a następnie określić liczbę kolonii zawierających więcej niż 25 komórek na kolonię, używając mikroskopu odwróconego lub wizualizacji.

Kolonie są duże i składają się z kilkuset komórek, jak pokazano tutaj, oraz wykazują fenotyp mezenchymalny. MSC zostały wyizolowane zgodnie z instrukcją w tym filmie i wysiane na płytkach 96-dołkowych w celu symulacji wzrostu. Następnie do MSC z płuc dodano zatrzymane w rozwoju komórki prezentujące antygen znakowane CFSE.

Proliferację izolowanych MSCs zmierzono następnie jako spadek średniej intensywności fluorescencji CFSE w porównaniu do tła, którym były same komórki T znakowane CFSE, jak pokazano na tej figurze, w nieobecności komórek SC płuc i w obecności komórek prezentujących antygen, APC plus minus albuminy OVA CD 40 dodatnich efektorowych komórek T, które wykazują spadek intensywności CFSE, co wskazuje na proliferację zaznaczoną na czerwono. Intensywność fluorescencji CFSE błony komórkowej komórek T spada geometrycznie przy każdym podziale komórki, tj. o połowę przy każdym podziale. W obecności płucnych MSC APC plus minus OVA CD 40 dodatnich efektorowych komórek T nie wykazano istotnej zmiany intensywności CFSE, co wskazuje na brak proliferacji po ich rozwoju. Technika ta otworzyła badaczom z dziedziny biologii macierzystych komórek płuc drogę do zbadania roli mezenchymalnych komórek macierzystych w chorobach płuc, takich jak nadciśnienie tętnicze płuc i włóknienie płuc.

Po opanowaniu tej techniki, postępowanie zgodnie z opisaną procedurą zajmuje około pięciu godzin. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania można przeprowadzić inne metody, takie jak testy różnicowania, aby sprawdzić, czy domniemandane mezenchymalne komórki macierzyste płuc wykazują odpowiednie różnicowanie wieloliniowe oraz potencjał do przekształcania się w kość, tłuszcz i chrząstkę.