Technologia zasiewiania autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka oraz badanie biokompatybilności urządzeń sercowo-naczyniowych w modelu dużych zwierząt

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zasiedlenie implantów naczyniowych autologicznymi komórkami progenitorowymi śródbłonka pochodzącymi z krwi, a następnie obserwacja wpływu tej terapii na zakrzepicę w modelu dużych zwierząt. Cel ten osiąga się poprzez pobranie próbki krwi obwodowej od świń w celu wyizolowania późnych komórek progenitorowych śródbłonka świni (late outgrowth porcine endothelial progenitor cells). Następnie wykorzystuje się urządzenie implantowalne.

Tytanowa rurka w naszym badaniu dowodzącym koncepcji została obsadzona autologicznymi PC. Następnie urządzenie zaimplantowano do żyły głównej dolnej świni. Wyniki wykazują ochronę przed zakrzepicą, co oparto na drożności tytanowej rurki obsadzonej EPC w przeciwieństwie do kontrolnej, niedrożnej rurki z gołego metalu.

Klinika chirurgii Uniwersytetu Duke dąży do wspierania przełomowych i innowacyjnych badań. Poniższa prezentacja jest przykładem współpracy międzywydziałowej i interdyscyplinarnej w celu rozwoju medycyny. Dr EK kieruje projektem badawczym nad opracowaniem technologii osadzania komórek, która ma zapobiegać zakrzepicy poprzez wyściełanie powierzchni urządzeń naczyniowych mających kontakt z krwią własnymi komórkami progenitorowymi pacjenta.

Ponieważ komórki te zostały pozyskane od tych samych pacjentów, którzy otrzymają implant, unikamy odrzucenia przez układ odpornościowy. Nasz sukces oraz opisane tutaj metody są wynikiem wysiłku całego zespołu. Implantację chirurgiczną zademonstrują Sean Gage z oddziału chirurgii naczyniowej, Whitney Lane, studentka medycyny na Duke University oraz ja.

Chciałbym teraz przedstawić Alexandra Janssena, doktoranta z Katedry Inżynierii Biomedycznej, który szczegółowo omówi proces zasiewania komórek. Zademonstruję, jak zasiewać rurki tytanowe endotelialnymi komórkami progenitorowymi pochodzącymi z krwi bezpośrednio przed implantacją w modelu świni. Metoda ta służy jako dowód koncepcji, a te same podstawowe zasady można zastosować do wielu innych urządzeń implantowalnych, takich jak stenty z nitinolu i mechaniczne urządzenia wspomagania krążenia. EPC są izolowane poprzez wysiew frakcji komórek jednojądrowych krwi świń i zazwyczaj pojawiają się po około siedmiu dniach.

Można je rozpoznać po typowej morfologii przypominającej brukowanie. Namnażaj EPC do całkowitej liczby 9 milionów komórek w hodowli. Przepłucz przygotowane EPC dwukrotnie w medium bezsurowiczym, dbając o ograniczenie ekspozycji na światło podczas i po znakowaniu.

Następnie należy pokryć komórki markerem fluorescencyjnym PKH 26 i odnotować objętość naniesionego roztworu. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Przerwać reakcję znakowania, dodając minutę później do roztworu barwnika taką samą objętość surowicy wieprzowej.

Rozcieńczyć połączone roztwory w stosunku jeden do jednego pełną pożywką wzrostową. Następnie odessać ciecz i przepłukać komórki trzykrotnie pełną pożywką wzrostową, a następnie dwukrotnie przemyć DPBS bez chlorku wapnia i magnezu. Następnie pokryć komórki trypsyną, odnotowując zużytą objętość, i inkubować je w temperaturze 37 °C.

Po trzech minutach inkubacji należy sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki oddzieliły się od podłoża, a jeśli tak, dodać dwukrotność objętości roztworu neutralizującego trypsynę, która została dodana wcześniej. Po neutralizacji trypsyny należy połączyć zawiesiny komórkowe w jednej probówce i zmierzyć gęstość komórek za pomocą cytometru hematologicznego. Na koniec należy odwirować zawiesinę komórkową, a otrzymany osad resuspenderować w co najmniej 4.5 milliliters medium bezsurowiczego.

Po przygotowaniu świni do zabiegu, wykonaj nacięcie w linii pośrodkowej za pomocą ostrza skalpela nr 15, zaczynając od drugiej pary gruczołów mlekowych. Ostrożnie prowadź nacięcie do przedostatniej pary gruczołów, używając elektrokoagulatora. Kontynuuj preparację aż do powięzi brzusznej.

Unieś otrzewną za pomocą kleszczyków typu mosquito i ostrożnie przetnij ją nożyczkami Metzenbauma, wyciągnij pęcherz moczowy na zewnątrz i nałóż szew sakulacyjny z nici Vicryl 3-0 w ścianie pęcherza. Wykonaj nacięcie punktowe w jego centrum i wprowadź do nacięcia cewnik Foleya 16 Fr. Następnie podawaj płyny dożylnie, aby utrzymać diurezę na poziomie co najmniej 1 mL/kg/h podczas operacji.

Następnie należy wyprowadzić na zewnątrz niewielką, poszerzoną pętlę jelita i umieścić dwa retraktory chirurgiczne Bour, aby odsłonić tylną część jamy otrzewnej, a następnie zidentyfikować żyłę główną dolną (IVC), stosując ostrą i tępą dyssekcję. Należy ostrożnie uwolnić IVC z otaczających tkanek. Następnie należy przeprowadzić szkieletyzację naczynia od prawej tętnicy nerkowej proksymalnie do rozwidlenia IVC dystalnie.

Podczas preparowania żyły głównej dolnej (IVC) należy zachować szczególną ostrożność, ponieważ nawet bardzo niewielki defekt w IVC może doprowadzić do gwałtownego krwotoku i wykrwawienia podwiązanego zwierzęcia. Należy podwiązać wszystkie odgałęzienia boczne segmentu IVC, zwracając szczególną uwagę na preparowanie i podwiązywanie dwóch dużych żył lędźwiowych tylnych znajdujących się bezpośrednio proksymalnie względem rozwidlenia IVC. Po stronie tylnej często występuje duża żyła lędźwiowa.

Wypreparuj tę żyłę i zabezpiecz ją za pomocą pętli naczyniowych. Teraz, równolegle do przebiegu operacji, rozpocznij zasiewanie implantu komórkami EPC przed przystąpieniem do tej procedury. Rusztowania do osadzania tkanki w rurce tytanowej muszą być w pełni zmontowane i gotowe do użycia w polu jałowym.

Otwórz sterylizowaną gazowo rurkę tytanową z zestawem w strzykawce 5 cc. Następnie wyjmij tłok ze strzykawki 5 cc, ale go nie wyrzucaj. Przymocuj zakrętkę do strzykawki. Za pomocą pipety napełnij strzykawkę zawiesiną EPC.

Następnie załóż tłok. Zdejmij nasadkę i wsuń koniec strzykawki z łącznikiem do otwartego silikonowego przewodu zestawu, aż będzie on dopasowany. Następnie usuń pęcherzyki powietrza, powoli przesuwając roztwór komórkowy, aż dotrze on do górnej części głowicy.

Następnie zamknąć układ za pomocą nakrętki Luer i szczelnie zakleić go taśmą, pracując w sterylnej rękawiczce. Cały tak przygotowany układ umieścić w precyzyjnie wykonanym uchwycie do strzykawki, a następnie włożyć do inkubatora ustawionego na 37 °C. Użyć poziomicy, aby upewnić się, że komory osadzające znajdują się w poziomie, i inkubować układ przy łagodnej rotacji.

Kontynuuj zabieg bezpośrednio po podwiązaniu IVC, podając 100 jednostek heparyny na kilogram masy ciała świni. Następnie natychmiast załóż klamry na IVC pod kątem 45 stopni, najpierw dystalnie na IVC i żyłę lędźwiową, a następnie proksymalnie. W dalszej kolejności, używając ostrza skalpela nr 11 i nożyc tętniczych, wykonaj czterocentymetrową podłużną wenotomię między klamrą proksymalną a dystalną.

Usunąć krew z IVC i przepłukać jego wewnętrzny światło sterylnym DPBS. Następnie wprowadzić do IVC implant z osadzonymi EPC lub kontrolną gołą metalową konstrukcję, aby zapobiec wysychaniu komórek i usunąć powietrze. Wypełnić IVC roztworem DPBS z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu.

Następnie zamknąć wenotomię za pomocą szwu ciągłego z nici Prolene 4-0 i usunąć jeden zacisk proksymalny, aby odpowietrzyć żyłę główną dolną (IVC) poprzez kontrolowane, niewielkie krwawienie wsteczne. Po odprowadzeniu powietrza usunąć zacisk dystalny, aby utrzymać implant na miejscu. Założyć szew stabilizujący do rurki PVC przechodzącej przez ścianę żyły.

Zamknij powięź szwem OPDS za pomocą igły CT. Zamknij przestrzeń podskórną dwoma szwami ciągłymi Vicryl. Następnie zamknij skórę za pomocą zszywek.

Podać podskórnie do 20 mililitrów 0,25% Marcaine wzdłuż miejsca nacięcia, a ranę zabezpieczyć gazą i tegadermem w celu uśmierzenia bólu. W razie potrzeby podać podskórnie flu Nixon oraz oksymorfon. Po zakończeniu znieczulenia i przebudzeniu się świni, umieścić ją z powrotem w klatce na kolejne siedem dni.

Podawaj atri co 24 godziny jako antybiotyk profilaktyczny i upewnij się, że plaster z fentanylem zaaplikowany przed operacją pozostaje przyklejony przez łącznie trzy dni. Po trzech dniach usunięto osadzone tytanowe implanty rurkowe i zbadano ich powierzchnie wewnętrzne. Przy długości fali wzbudzenia 550 nanometrów w drugiej rurce stwierdzono obecność konfluentnej warstwy komórek znakowanych fluorescencyjnie.

Komórki w przekrojach dodatkowo barwiono markerem adhezji płytek krwi do komórek śródbłonka, aby uwidocznić granice komórek. W tej procedurze można zastosować szeroką gamę barwień. W przeciwieństwie do tego, implant w postaci gołej rurki tytanowej ulega całkowitemu zamknięciu w prozakrzepowym środowisku o niskim ścinaniu w żyle głównej dolnej.

Jak pokazano na obrazach A i C, osadzona w komórce rurka tytanowa przedstawiona jest na obrazie B i pozostała wolna od skrzepu po zastosowaniu naszej procedury izolacji z krwi szczytowej. EPC pojawiają się średnio po siedmiu dniach hodowli. Podczas wykonywania procedury chirurgicznej bardzo ważne jest uważne i delikatne wypreparowanie IVC, ponieważ nawet najmniejsze przerwanie IVC lub jego odgałęzień bocznych może prowadzić do wykrwawienia świni. Po tej procedurze inne materiały kontaktujące się z krwią mogą zostać szybko endotelializowane, aby zapobiec zakrzepicy.

Stenty naczyniowe wyścielone śródbłonkiem, na przykład z wykorzystaniem naszych EPC, naśladują naturalną wyściółkę ściany naczynia krwionośnego i mogą zapobiegać restenozie oraz zakrzepicy stentu po jego wszczepieniu. Nasza technologia szybkiej aplikacji umożliwi wyścielanie urządzeń wewnątrznaczyniowych pochodzącymi z krwi pacjenta komórkami progenitorowymi śródbłonka w ciągu kilku minut na sali operacyjnej lub w pracowni hemodynamicznej. Eliminuje to tym samym konieczność przedłużonej hodowli ex vivo.

Unika się czasu spędzonego bezpośrednio na urządzeniu, dzięki czemu technologia ta staje się praktyczna do wdrożenia w praktyce klinicznej.