Wizualizacja białek i kompleksów makromolekularnych za pomocą EM z barwieniem negatywowym: od przygotowania siatki do akwizycji obrazów

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja oczyszczonych próbek białek za pomocą elektronowej mikroskopii z zastosowaniem barwienia negatywowego. Jest to realizowane poprzez wstępne przygotowanie siatek do mikroskopii elektronowej, które będą stanowić podłoże dla próbki. Drugim krokiem procedury jest przygotowanie roztworu do barwienia negatywowego.

Następnie próbkę nanosi się na siatkę do mikroskopii elektronowej i poddaje barwieniu negatywowemu. W ostatnim kroku siatkę EM umieszcza się w mikroskopie elektronowym i rejestruje obrazy przy odpowiednich warunkach optycznych. Konwencjonalne obrazy w jasnym polu (DEM) charakteryzują się wysokim kontrastem i ostrym odwzorowaniem szczegółów, ukazując pojedyncze makrocząsteczki rozproszone na jednolitym tle.

Elektronowa mikroskopia z negatywnym barwieniem jest prostą metodą wizualizacji wybranych białek. Może być stosowana jako rutynowy test do badania oczyszczonego białka, zarówno w celu analizy strukturalnej, jak i w innych testach biochemicznych i biofizycznych. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przygotować próbkę z negatywnym barwieniem do mikroskopii elektronowej.

Wizualna demonstracja tej metody jest pomocna, ponieważ niektóre z etapów są trudne do opanowania na podstawie opisów tekstowych i rycin. Należy rozpocząć od użycia pipety szklanej do naniesienia pojedynczej kropli kolodionu na powierzchnię wody w dużym zlewce z wodą. W miarę rozprzestrzeniania się kolodionu może on wychwytywać kurz z powierzchni wody.

Usunąć zakurzoną warstwę plastiku kolodionowego i zastąpić ją kolejną kroplą. Następnie umieścić po kolei od 50 do 100 siatek EM na pływającej warstwie plastiku, stroną błyszczącą skierowaną w dół. Do rutynowego barwienia negatywowego wybrać siatki o oczkowaniu 400 mesh oraz siatki o oczkowaniu 200 mesh.

Do zbierania obrazów par nachylenia. Wybrać kawałek gładkiego papieru o niskiej chłonności, który jest nieco większy niż powierzchnia siatek. Położyć papier na siatkach i odczekać, aż papier stanie się całkowicie mokry.

Papier nie powinien absorbować wody zbyt szybko. Używamy papieru z taniego notesu. Siatki znajdują się teraz pomiędzy folią plastikową a papierem.

Za pomocą pęsety umieść papier w szalce Petriego, aby powoli wyschł na powietrzu. Unikaj szybszych metod suszenia, ponieważ mogą one prowadzić do powstawania zmarszczek. Urządzeniem do napylania węgla używanym w naszym laboratorium jest wysokopróżniowy turbo-napylacz węgla Creston 2 0 8 C.

Wyposażone w monitor grubości warstwy Creston. Monitor wykorzystuje wagę kwarcową, która jest wrażliwa na osady węglowe. Jednak protokół opisany tutaj nie wymaga użycia tego urządzenia. Rozpocznij od zaostrzenia i załadowania prętów węglowych do urządzenia do napylania węgla.

W kolejnym kroku należy pokryć smarem próżniowym szkiełko przedmiotowe, pozostawiając połowę obszaru matowego bez powłoki. Po napylaniu węgla obszary szkiełka pokryte smarem służą do oszacowania grubości warstwy węgla. Umieść papier z siatkami na stole pod kloszem urządzenia do napylania węgla. Ustaw wysmarowane szkiełko.

Przesuń preparat obok siatek. Odpompuj komorę próżniową do wartości co najmniej 10 micro tours, w przeciwnym razie wyładowania iskrowe spowodują powstanie wielu dużych cząstek na siatce. Teraz bardzo powoli zwiększaj natężenie prądu.

Ostra końcówka pręta węglowego stanie się niezwykle jasna. Nie należy obserwować jej gołym okiem w momencie rozpoczęcia procesu napylania; w miarę narastania warstwy węgla szkiełko przedmiotowe zmieni kolor na ciemnoszary. Przerwij przepływ prądu po osiągnięciu pożądanej grubości warstwy węgla, biorąc pod uwagę przezroczystość klosza. Po skalibrowaniu stopnia zaciemnienia szkiełka względem grubości warstwy węgla, metoda ta jest równie dokładna jak droższy monitor grubości filmu.

Po zakończeniu procesu wypuść powietrze do komory próżniowej i wyjmij powlekane siateczki do późniejszego użycia. Cienka warstwa plastiku nie wpłynie na jakość obrazu z barwienia negatywowego, ale można ją usunąć, namaczając siateczki w chloroformie przez kilka godzin przed przystąpieniem do dalszych prac. Przygotuj świeży roztwór mrachianu uranylu lub użyj roztworu przechowywanego w ciemności przez mniej niż dwa tygodnie.

Świeży roztwór dobrej jakości ma żółty kolor, pH w okolicach czterech i jest bardzo przejrzysty, bez żadnych osadów. Rozpocznij od użycia dostępnego komercyjnie systemu do glow-discharge. Przeprowadź rozładowanie siatek powlekanych węglem.

Następnie nanieś dwie krople wody destylowanej o objętości 20 µl oraz dwie krople świeżego roztworu mrअधिकczanu mocznika o objętości 25 µl na kawałek folii Perfil. Używając pęsety antykapilarnej o odwróconej sile, przytrzymaj siatkę poddaną wyładowaniom żarowym stroną pokrytą węglem do góry. Kluczowe jest, aby pęsety te nie odsysały cieczy z siatek.

Następnie nanieś 2 µL próbki białka na siatkę i odczekaj, aż białka zostaną wchłonięte przez siatkę. Zazwyczaj trwa to 30 s, jednak bardzo rozcieńczone próbki wymagają więcej czasu, co może wpłynąć na stężenia buforów. Po zakończeniu odsącz nadmiar próbki białka za pomocą papieru filtracyjnego.

Następnie przemyj siatkę dwukrotnie, krótko dotykając jej powierzchni kroplą wody, a następnie osuszając ją poprzez odsączenie w ciągu kilku sekund. Po krótkim kontakcie wody z siatką, dotknij jej powierzchnią kroplą barwnika i szybko osusz poprzez odsączenie. Stosując tę samą technikę, pozostaw siatkę w kontakcie z drugą kroplą barwnika na 20 sekund.

Na koniec wysuszyć siatkę na powietrzu w dygestorium lub najlepiej w próżni przed sesją EM; sprawdzić ustawienie mikroskopu EM, ładując plik optymalnego ustawienia, jeśli jest dostępny, co powinno przywrócić sprzęt do stanu niemal idealnego. Następnie umieścić siatkę EM w standardowym uchwycie do próbek z jednopłaszczyznowym nachyleniem. Na koniec wsunąć uchwyt do stolika mikroskopu.

Następnie należy odczekać do zakończenia cyklu pompowania i włożyć uchwyt do kolumny. Teraz należy rozpocząć poszukiwanie obszaru próbki z dobrym zabarwieniem. Ustaw ostrość ręcznie, stosując metodę minimalnego kontrastu lub korzystając z kamery CC, D i obliczając obraz na żywo.

Twoje widmo mocy. Następnie ustaw głębokość ostrości w zależności od potrzeb, zazwyczaj na -1,5 µm. Stężenie barwnika może różnić się w obrębie siatki, dlatego należy szukać białek o białym kontraście.

Należy unikać obszarów z nierównomiernym barwieniem lub barwieniem pozytywnym, w których kontrast białek staje się czarny. W celu przygotowania siatek i wizualizacji próbek barwionych negatywnie zastosowano opisane podejście. W celach demonstracyjnych wykonano obrazowanie kilku znanych białek.

Zwróć uwagę na ich szczegółowość oraz ostry kontrast. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować próbki makrocząsteczek poddanych barwieniu negatywnemu do obserwacji w mikroskopie elektronowym. Po opanowaniu techniki, jej wykonanie zajmuje około czterech godzin.

Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak rekonstrukcja 3D, aby lepiej zrozumieć struktury molekularne.