Wysokoprzepustowy test sacharyfikacji materiałów lignocelulozowych

Cześć, jestem Kara Ted, ja jestem Leo. Moja kolej. A ja jestem Simon McQueen Mason.

Strawność biomasy roślinnej jest obecnie tematem budzącym duże zainteresowanie. Wynika to z faktu, że w polisacharydach ścian komórkowych roślin tworzących tę biomasę uwię져 jest znaczna ilość cukrów, a jeśli uda nam się pozyskać te cukry w formie przydatnej, możemy poddać je fermentacji w celu produkcji różnorodnych produktów, takich jak paliwa i chemikalia. Niestety, materiały te są niezwykle trudne do strawienia, dlatego pilną kwestią jest lepsze zrozumienie czynników kontrolujących tę strawność.

Aby móc wykorzystać materiał roślinny do produkcji grupy odnowy, musimy być w stanie zmierzyć potencjał sakaryfikacji tych roślin. Dlatego tutaj, na Uniwersytecie w Yorku, przesiewamy duże populacje materiału roślinnego, aby określić ich potencjał sakaryfikacji. Sakaryfikacja jest procesem rozkładu złożonych węglowodanów na ich komponenty monosacharydowe w celu wytworzenia cennych chemikaliów za pomocą różnych procesów przemysłowych.

Aby zmierzyć potencjał sacharyfikacji, odtwarzamy procesy przemysłowe w skali mikro, poddając biomasę obróbce wstępnej oraz hydrolizie enzymatycznej w celu oznaczenia uwolnionych cukrów. Pozwala to na zidentyfikowanie interesujących wariantów genotypowych. System wysokoprzepustowy pracuje w formacie sześciodołkowej płytki IG.

Łagodne warunki hydrolizy są stosowane w celu ujawnienia subtelnych różnic między genotypami; są one również na tyle elastyczne, że pozwalają na wykorzystanie różnych materiałów substratowych oraz ocenę różnych enzymów. Stosowana przez nas metoda polega na sprowadzeniu materiału roślinnego do postaci proszku, który następnie poddaje się wstępnej obróbce rozcieńczonym kwasem lub zasadą w temperaturze 90°C przez 20 minut. Następnie przeprowadzany jest trawienie enzymatyczne z użyciem komercyjnej mieszaniny celulaz w temperaturze 50°C przez osiem godzin.

Na koniec, do oznaczenia uwalniania cukrów redukujących stosuje się metodę MBTH. Materiał roślinny jest zbierany w formie suchych łodyg, które tnie się na cząstki o długości 4 mm. Są one umieszczane w fiolkach o pojemności 2 ml wraz z trzema metalowymi kulkami o średnicy 5 mm.

Fiolki są indywidualnie oznakowane kodami kreskowymi, które są skanowane w celu zapewnienia identyfikowalności próbek. Próbki są ładowane do robotów do mielenia i formatowania. Próbki są automatycznie mielone i mieszane, aby umożliwić dozowanie biomasy do płytki 96-dołkowej.

Fiolki są przebijane, a następnie każda z nich jest ponownie ustawiana w ramieniu robota tak, aby znajdowała się w lejku, który wibruje w celu dozowania proszku. Wibracje lejka są regulowane przez wagę, aby uzyskać docelową masę dozowaną na każdą studzienkę. Biomasa jest dozowana do 10 kolumn płytek, przy czym dwie kolumny pozostają wolne dla standardów.

Wykonując cztery powtórzenia dla każdej próbki, ładujemy 20 próbek na jedną płytkę. Hydrolizat z tej płytki zostanie naniesiony w trzech powtórzeniach na płytki PCR, co da trzy płytki optyczne. W ten sposób otrzymujemy trzy oznaczenia cukrów redukujących dla każdej studni biomasy.

Po sformatowaniu płytki są uszczelniane matą silikonową, aby zapobiec odparowywaniu. Gdy są gotowe, zostają przeniesione do robota do obsługi cieczy. W robotach do obsługi cieczy obróbka wstępna, hydroliza enzymatyczna oraz oznaczanie uwolnionych cukrów są wykonywane automatycznie.

Dwumetrowy stół wyposażony jest w pojemniki na poszczególne niezbędne odczynniki oraz miejsce do przechowywania wyrobów z tworzywa sztucznego. Znajdują się tu inkubatory do obróbki wstępnej i hydrolizy, a także termocyklery do oznaczania zawartości cukrów. Obróbka wstępna jest przeprowadzana w płytce głęboko dołkowej.

Poprzez dodanie rozcieńczonych roztworów kwasowych lub zasadowych do proszku z biomasy. Płytki przenosi się do bloku grzejnego i inkubuje w temperaturze 90 °C przez 20 minut. Po zakończeniu inkubacji pozostałości po obróbce wstępnej usuwa się poprzez pięciokrotne płukanie 500 µl buforu octanowego.

Po wypłukaniu preparatu wstępnie potraktowanego dodaje się koktajl enzymatyczny. Jest to standardowa mieszanina. Zawiera ona celulazę oraz novozyme 1, 8 8 w stosunku cztery do jednego, przy stężeniu 7 FPU na dołek.

Płytki inkubuje się przez osiem godzin w temperaturze 50 °C przy wytrząsaniu. 75 µl otrzymanego hydrolizatu przenosi się na płytkę do PCR. W kolumnach 11 i 12 płytek do PCR dodaje się wzorce glukozy.

Następnie do wszystkich studni dodaje się 25 µL 1 M wodorotlenku sodu. Na koniec do płytki PCR pipetuje się 50 µL odczynnika MBTH. Płytka z głębokimi studniami jest przechowywana po zakończeniu przenoszenia hydrolizatu do trzeciej płytki PCR.

Płytki PCR przenosi się do termocyklerów w celu inkubacji w temperaturze 60 °C przez 15 minut. Ostatnim etapem procesu jest przeniesienie mieszaniny reakcyjnej na płytki optyczne w celu wywołania barwy. Po inkubacji płytki PCR wyjmuje się z termocyklera.

Do przeniesionej mieszaniny reakcyjnej dodaje się 100 µL odczynnika utleniającego. Aby ułatwić rozwój barwy, proces dozowania cieczy jest powtarzany czterokrotnie w ciągu 24 godzin, przy czym płukanie wstępne i dodanie enzymu zajmuje około dwóch godzin. Hydroliza enzymatyczna trwa osiem godzin, a oznaczenie cukrów kolejne dwie godziny.

Podczas gdy pierwsza płytka inkubuje się przez osiem godzin, rozpoczyna się proces z kolejną płytką. Dzięki takiemu rozmieszczeniu zasobów robota osiągana jest wydajność na poziomie 80 próbek dziennie w celu określenia ilości uwolnionych cukrów redukujących. Płytki optyczne są odczytywane przy 620 nanometrach.

Uzyskane wyniki są analizowane w celu określenia ilości uwolnionych cukrów jako nanomoli na miligram na godzinę reakcji. Dziękujemy za oglądanie i mamy nadzieję, że zainspiruje to Państwa badania nad biopaliwami.