Podłużna ocena utraty masy kostnej kończyn tylnych myszy po urazie rdzenia kręgowego z wykorzystaniem nowej metodologii in vivo
7 grudnia 2011
Przeprowadzono podłużną analizę ubytku kostnego w kościach udowych i piszczelowych u dorosłych myszy po urazie rdzenia kręgowego, wykorzystując sekwencyjne skanowanie rentgenowskie w niskiej dawce. Ubytek kostny w obrębie kości piszczelowych stwierdzono przez cały okres trwania badania, natomiast ubytek w kości udowej wykryto dopiero 40 dni po urazie.
Niniejsza procedura demonstruje nowatorską metodę służącą do wykrywania i ilościowego określania zależnej od czasu utraty gęstości kości kończyn tylnych u myszy po urazie rdzenia kręgowego. Proces ten polega najpierw na wykonaniu przecięcia rdzenia kręgowego u znieczulonej myszy w warunkach sterylnych i zgodnie z wytycznymi ALAC. Następnie, po okresie rekonwalescencji, zwierzę zostaje ponownie znieczulone, a następnie wykonuje się zdjęcia rentgenowskie kości piszczelowej i strzałkowej obu kończyn tylnych (prawej i lewej).
Procedurę tę przeprowadza się co tydzień do 40 dni po urazie. Następnie wykonuje się analizę obrazu skanów rentgenowskich. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie pośmiertnej oceny gęstości kości w wyciętych kościach kończyn tylnych.
Ostatecznie wyniki pokazują, w jaki sposób uraz rdzenia kręgowego indukuje szybką i postępującą utratę gęstości kości w kończynach tylnych myszy. Ta nowatorska metoda zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną i czasową, wykorzystując niższe dawki promieni rentgenowskich niż w innych modalnościach obrazowania. Osteoporoza jest stanem zagrażającym życiu, który dotyka osoby żyjące z urazem rdzenia kręgowego.
Proponujemy nową metodę do zastosowania w badaniach nad urazami rdzenia kręgowego u zwierząt, która pozwala badaczowi na długofalowe śledzenie utraty masy kostnej związanej z osteoporozą. Jest to istotne z dwóch powodów. Po pierwsze, stworzy to możliwość zbadania mechanizmów kształtujących rozwój osteoporozy.
Po drugie, metoda ta umożliwia testowanie nowych interwencji zaprojektowanych w celu zapobiegania lub potencjalnego cofnięcia rozwoju osteoporozy u pacjentów z urazem rdzenia kręgowego. Choć metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie osteoporozy wywołanej urazem rdzenia kręgowego, można ją również zastosować do innych układów, takich jak utrata masy kostnej związana z wiekiem u kobiet w okresie pomenopauzalnym, a także do innych redukcji gęstości kości wywołanych urazami; brak obciążenia kończyn wynikający z unieruchomienia, po złamaniach lub innych uszkodzeniach może prowadzić do znacznej utraty tkanki kostnej w procesie gojenia. Zastosowanie podłużnego obrazowania całego zwierzęcia za pomocą niskodawnego promieniowania rentgenowskiego może otworzyć nowe możliwości opracowania terapii mających na celu minimalizację lub zapobieganie tym problemom.
Przeprowadzić operację uszkodzenia rdzenia kręgowego zgodnie z procedurami sander oraz zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnej komisji ds. opieki i wykorzystania zwierząt. Następnie, począwszy od 10. dnia po operacji rdzenia kręgowego i kontynuując w odstępach 10-dniowych aż do 40. dnia, ocenić prawe i lewe kości udowe oraz piszczelowe żyjących, znieczulonych zwierząt z przetnątym rdzeniem kręgowym oraz nieuszkodzonych kontroli o odpowiadającym wieku, wykonując skanowanie za pomocą systemu ivus Lumina XR. Przed skanowaniem zainicjować urządzenie Lumina XR, aby wewnętrzna kamera osiągnęła temperaturę operacyjną minus 90 stopni Celsius.
Umieść znieczulone zwierzę na platformie w urządzeniu Lumina xr. Następnie włóż obiektyw o dużym powiększeniu, aby umożliwić ustawienie ostrości zarówno na obszarze kości udowej, jak i piszczelowej. Sprawdź, czy obiekt jest odpowiednio ustawiony w polu widzenia.
W razie potrzeby należy otworzyć drzwiczki i zmienić położenie zwierzęcia. Prawidłowe ułożenie zwierzęcia pokazano tutaj. Po właściwym ustawieniu można wykonać funkcję RTG.
Wybierz z rozwijanej listy energii wartość odpowiednią dla zwierząt. Następnie otwórz panel sterowania. Włącz funkcję promieni rentgenowskich, zaznaczając pole x-ray, i wykonaj zdjęcie rentgenowskie.
Cała kość udowa i piszczel powinny być widoczne, tak jak pokazano tutaj. Ponieważ oprogramowanie do obrazowania na żywo domyślnie wyświetla przetworzone obrazy rentgenowskie, należy upewnić się, że wyświetlane są surowe obrazy rentgenowskie, wchodząc do menu narzędzi filtrowania korekcji i odznaczając opcję absorpcji promieni rentgenowskich. Surowe dane obrazu są automatycznie zapisywane na dysku twardym.
Zapisywane są również reprezentatywne pliki TIFF. Po obrazowaniu mysz jest zwracana do swojej klatki domowej, gdzie może dojść do regeneracji pod obserwacją badacza. Następnie proces powtarza się z kolejną myszą.
W pierwszej kolejności uruchom oprogramowanie, klikając dwukrotnie ikonę living image w pojawiającym się oknie dialogowym. Wybierz interesujący Cię folder i zatwierdź wybór, klikając OK. Załaduj obraz rentgenowski, klikając przycisk przeglądaj.
Przeglądarka obrazów na żywo wyświetla wybrane dane wraz z identyfikatorem użytkownika. Informacje o etykietach oraz konfiguracji kamery. Aby otworzyć dane, kliknij dwukrotnie w wiersz danych. Wyświetlą się obraz oraz paleta narzędzi.
Otwarte dane są podświetlone na niebiesko w przeglądarce. Następnie kliknij narzędzia ROI. W palecie narzędzi w sekcji ROI tools otwórz listę rozwijaną typu i wybierz obszar pomiarowy ROI.
Aby załadować trzy ROI wykorzystane w tym eksperymencie, kliknij ikonę kwadratu i załaduj kwadraty. Używając linijki, zmierz długość kości udowej, a następnie dostosuj długość dwóch kwadratów tak, aby stanowiły one jedną ósmą całkowitej długości kości udowej. Dostosuj szerokość kwadratów tak, aby stanowiły jedną dwudziestą czwartą całkowitej długości kości udowej.
Teraz za pomocą linijki odmierz jedną ósmą odległości od proksymalnego końca kości udowej i umieść jeden prostokąt tak, aby był wycentrowany w tej pozycji. Przesuń drugi prostokąt do dystalnego końca kości udowej i umieść go tak, aby znajdował się w centrum obszaru beleczkowego kolana. Następnie zmierz długość kości piszczelowej.
Dostosuj długość ramki tak, aby stanowiła jedną ósmą całkowitej długości kości piszczelowej. Dostosuj szerokość do jednej trzydziestej całkowitej długości kości piszczelowej. Na koniec umieść ramkę w taki sposób, aby była wycentrowana i znajdowała się w odległości jednej ósmej całkowitej długości kości piszczelowej od proksymalnego końca kości piszczelowej, jak pokazano tutaj.
Następnie należy kliknąć ikonę pomiaru; na obrazie rentgenowskim pojawią się pomiary intensywności ROI, a także pojawi się tabela pomiarów ROI. Wyeksportuj tę tabelę do wybranej lokalizacji jako plik CSV z kropką w roli separatora. Pozwoli to na otwarcie tabeli w programie Excel.
Powtórz ten krok dla wszystkich zapisanych obrazów przeznaczonych do analizy. Na koniec zbiorczym zestawieniem wszystkich danych w jednym arkuszu programu Excel. Istotność statystyczną określa się za pomocą testu t-Studenta, wykorzystując oprogramowanie takie jak Microsoft Excel lub Sigma Plot 11.0; jeśli jest to pożądane, wyniki można porównać z wynikami uzyskanymi z analizy gęstości kości pośmiertnie, przeprowadzanej metodą densytometrii dwuenergetycznej promieniowania rentgenowskiego zgodnie ze standardowymi protokołami dla tej metody.
Względna utrata gęstości kości piszczelowej i udowej myszy po urazie rdzenia kręgowego w porównaniu z myszami naiwnymi jest wykrywalna przy użyciu powyższej metody. Rycina ta przedstawia utratę gęstości kości w bliższym odcinku kości piszczelowej 10, 20, 30 i 40 dni po urazie rdzenia kręgowego. W porównaniu z grupą kontrolną myszy naiwnych w tym samym wieku, już po 10 dniach obserwuje się istotny 12% spadek gęstości kości piszczelowej, a w 40. dniu utrata gęstości kości sięga 15%.
Tutaj widzimy ubytek gęstości kości w bliższym odcinku uda po urazie rdzenia kręgowego w 10., 20., 30. i 40. dniu po urazie. W porównaniu z grupą kontrolną w tym samym wieku, w 40. dniu po urazie zaobserwowano 7% spadek gęstości kości w bliższym odcinku uda. Wykres ten przedstawia ubytek gęstości kości w dalszym odcinku uda w 10., 20., 30. i 40. dniu po urazie rdzenia kręgowego.
W porównaniu do naiwnych kontroli w tym samym wieku, utrata gęstości kości w dystalnej części kości udowej mogła być obserwowana już 10 dni po urazie i utrzymywała się przez resztę eksperymentu. Ten reprezentatywny obraz danych z geometrii absorpcji promieni rentgenowskich o podwójnej energii (DEXA) przedstawia wyniki zawartości mineralnej kości oraz gęstości mineralnej kości. Wycięte kości udowe przeanalizowano 40 dni po urazie rdzenia kręgowego.
Aby porównać skuteczność metody zaprezentowanej w niniejszym protokole z innymi obecnie dostępnymi metodami, na niniejszym rysunku przedstawiono analizę geometrii rentgenowskiej dwuenergetycznej zawartości mineralnej kości w gramach w kości udowej myszy 40 dni po operacji uszkodzenia rdzenia kręgowego w porównaniu z grupą kontrolną w tym samym wieku. Zaobserwowano istotną 12% utratę zawartości mineralnej kości u myszy z uszkodzeniem rdzenia kręgowego w porównaniu z grupą kontrolną.
Tutaj przedstawiono analizę gęstości mineralnej kości metodą podwójnej energii promieniowania rentgenowskiego (DEXA) w miligramach na centymetr kwadratowy w kości udowej myszy z urazem rdzenia kręgowego 40 dni po urazie w porównaniu z dopasowanymi wiekiem zdrowymi myszami kontrolnymi. Spadek gęstości mineralnej kości nie uległ znaczącej zmianie, lecz wykazywał trend podobny do zawartości mineralnej kości. Po opanowaniu techniki badanie to można przeprowadzić w 20 do 30 minut, jednak należy pamiętać o istotnym znaczeniu prawidłowego ustawienia kończyn tylnych.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo wiedzieć, jak przeprowadzić podłużną ocenę gęstości kości u żywych zwierząt po urazie rdzenia kręgowego przy użyciu urządzenia Lumina XR firmy Caliper Instruments.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nową metodę wykrywania i ilościowego określania utraty gęstości kości w kończynach tylnych myszy po urazie rdzenia kręgowego. Wykorzystując obrazowanie niskodawkowym promieniowaniem rentgenowskim, badacze mogą monitorować zmiany w czasie, co ujawniło znaczną utratę masy kostnej w kościach piszczelowych oraz opóźnioną utratę w kościach udowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- zdrowie kości
- techniki obrazowania
Wstęp
- Uraz rdzenia kręgowego często prowadzi do osteoporozy.
- Utrata gęstości kości może znacząco wpływać na powrót do zdrowia i jakość życia.
- Obecne metody obrazowania mogą nie zapewniać wystarczającej rozdzielczości czasowej.
- Obrazowanie rentgenowskie niskiej dawki stanowi obiecującą alternatywę.
Cel badania
- Opracowanie metody podłużnej oceny utraty gęstości kości po urazie rdzenia kręgowego.
- Zrozumienie mechanizmów osteoporozy w modelach urazu rdzenia kręgowego.
- Ocena potencjalnych interwencji zapobiegających utracie masy kostnej.
Zastosowane metody
- Wykonanie przerwania rdzenia kręgowego u znieczulonych myszy.
- Cotygodniowe obrazowanie rentgenowskie kości kończyn tylnych przez 40 dni.
- Analiza obrazów w celu ilościowego określenia zmian gęstości kości.
- Ocena pośmiertna wyciętych kości w celu walidacji.
Główne wyniki
- Wykryto znaczną utratę masy kostnej w kościach piszczelowych w trakcie całego badania.
- Utratę masy kostnej w kościach udowych zaobserwowano począwszy od 40. dnia po urazie.
- Metoda ta umożliwia szczegółowe monitorowanie zmian gęstości kości.
- Potencjalne zastosowania obejmują inne schorzenia wpływające na gęstość kości.
Wnioski
- Ta nowatorska metoda obrazowania dostarcza wiedzy na temat osteoporozy indukowanej urazem rdzenia kręgowego.
- Umożliwia ona badaczom analizę postępu ubytku kostnego w czasie.
- W przyszłych badaniach podejście to może zostać wykorzystane do testowania nowych interwencji terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Podłużna ocena utraty gęstości kości w modelach przedklinicznych umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w opracowywaniu terapeutyków przeciwosteoporotycznych. Metoda ta wspiera walidację celu poprzez kwantyfikację zmian gęstości kości kończyn tylnych zależnych od czasu po urazie rdzenia kręgowego. Zapewnia ona wiarygodność prognostyczną przy ocenie interwencji mających na celu zapobieganie utracie kości lub jej odwrócenie u populacji unieruchomionych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących mechanizmów utraty gęstości kości po SCI.
- Wartość operacyjna: Wspiera walidację funkcjonalną celów terapeutycznych poprzez mierzalne, podłużne pomiary BMD i BMC.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów z portfolio poprzez identyfikację celów o mierzalnym wpływie na zachowanie tkanki kostnej.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość testu: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do przesiewania związków z wykorzystaniem powtarzalnego obrazowania rentgenowskiego o niskiej dawce.
- Wyniki ilościowe: Generowanie standaryzowanych odczytów BMD i BMC, umożliwiających wiarygodną ocenę związków w różnych punktach czasowych.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Skalowalne możliwości obrazowania podłużnego, możliwe do zastosowania w wielu modelach utraty masy kostnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje osteoporozę indukowaną przez SCI z translacyjną zgodnością z utratą masy kostnej poniżej miejsca uszkodzenia u ludzi.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez seryjne monitorowanie gęstości kości in vivo.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza informacji do decyzji typu go/no-go w oparciu o podłużne trajektorie utraty masy kostnej oraz skuteczność interwencji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces badawczy, od walidacji celu po ewaluację przedkliniczną, umożliwiając wielokrotną ocenę zmian gęstości kości in vivo w czasie.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez ilościowe określanie postępu utraty masy kostnej w kościach piszczelowych i udowych po SCI.
- Przesiew: Zapewnia powtarzalność analizy i czułość ilościową w wykrywaniu wczesnych (kość piszczelowa, dzień 10.) i opóźnionych (kość udowa, dzień 40.) fenotypów utraty masy kostnej.
- Analityka: Dostarcza pomiary intensywności w oparciu o ROI oraz dane możliwe do eksportu do formatu CSV w celu porównania statystycznego za pomocą testów t.
- Badania translacyjne: Łączy z walidacją przedkliniczną poprzez pośmiertne potwierdzenie DXA utraty BMC wyznaczonej za pomocą IVIS Lumina XR (12% w 40. dniu).
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma obrazowania podłużnego dla modeli osteoporozy, zaniku z nieużywania oraz utraty masy kostnej związanej z wiekiem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez mechanistycznie istotne dane dotyczące utraty gęstości kości w czasie.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, powtarzalność oraz obrazowanie podłużne przy niskiej dawce w obrębie kohort.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez redukcję niepewności biologicznej w odczytach skuteczności działania na kości.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka na podstawie profilów długofalowego zachowania kości.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z gryzoniami, przeprowadzaniu operacji urazów rdzenia kręgowego oraz obrazowaniu żywych zwierząt.
- Zależne od instrumentarium IVIS Lumina XR z możliwością wykorzystania niskoenergetycznego promieniowania rentgenowskiego oraz oprogramowania do analizy ROI.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji protokołów obrazowania, schematów znieczulenia i definicji ROI dla obszarów kostnych.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody do różnych obszarów kostnych (kość piszczelowa vs. kość udowa) oraz modeli urazów innych niż SCI.
- Ograniczone przez konieczność walidacji pośmiertnej oraz potencjalną zmienność w pozycjonowaniu zwierząt i ich rekonwalescencji.
