Wizualizacja funkcji oddechowej mitochondriów przy użyciu histochemii z podwójnym znakowaniem oksydazy cytochromu C / dehydrogenazy bursztynianowej (COX/SDH)

Ogólnym celem niniejszej procedury jest umożliwienie bezpośredniej wizualizacji niedoborów enzymów oddechowych mitochondriów w świeżych mrożonych przekrojach tkankowych. Jest to realizowane poprzez pobranie w pierwszej kolejności skrawków z kriostatu z interesującego organu. Drugim krokiem procedury jest wykonanie oceny histochemicznej kompleksu COX, po której następuje ocena histochemiczna SDH.

Na koniec przekroje tkanek zostają odwodnione, osadzone i zabezpieczone szkiełkiem cover-slip. Ostatecznie wyniki pozwalają określić stopień dysfunkcji mitochondriów na podstawie natężenia niebieskiego barwienia komórkowego. Cześć. Dzisiaj omówimy technikę histochemicznej podwójnego znakowania Cox i SCH.

Choć metodę tę można zastosować do badania chorób mitochondrialnych, może ona również dostarczyć informacji na temat starzenia się oraz schorzeń związanych z wiekiem. Po wyjęciu mózgu zwierzęcia uśpionego zgodnie z pozwoleniem etycznym należy go szybko zamrozić na suchym lodzie. Zamrożoną tkankę można przechowywać w temperaturze -80 °C, zawiniętą w folię aluminiową, aż do momentu przygotowania przekrojów.

Przygotuj tkankę do kriosekcjonowania, umieszczając mózg na stole kriostatu i otaczając go medium do zatapiania. Szybko umieść stół w kriostacie i pobierz przekroje o grubości 14 micron przy temperaturze minus 21 °C. Rozmroź przekroje na szkiełkach za pomocą bloku grzejnego, a następnie pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Umieścić preparaty w komorze do barwienia z mokrymi paskami papieru. Ponieważ czasy reakcji są istotne w tym badaniu, zaleca się przetwarzanie maksymalnie 10 preparatów na eksperyment pod dygestorium chemicznym. Przygotować medium inkubacyjne zawierające dab i cytochrom C w PBS, a następnie wymieszać na wortexie.

Szybko dodaj 2 µg wołowych CDE do medium i dokładnie wymieszaj za pomocą wirówki vortex. Aby rozbić wszystkie ziarna CDE, pracując nadal w komorze z laminarnym przepływem powietrza, nanieś od 150 do 200 µL medium inkubacyjnego na każdy preparat, używając końcówki pipety do równomiernego rozprowadzenia cieczy na wszystkich sekcjach. Inkubuj preparaty przez 40 minut w temperaturze 37 °C.

Po 40 minutach usunąć medium inkubacyjne z szkiełek. Płukać szkiełka cztery razy w PBS, za każdym razem przez 10 minut. Po płukaniu, pracując pod wyciągiem chemicznym, umieścić szkiełka z powrotem w komorze do barwienia wraz z mokrymi paskami papieru.

Przygotuj roztwór NBT w PBS, pamiętając o zabezpieczeniu PMS przed światłem. Szybko wymieszaj roztwór w wstrząsarce wirowej, a następnie nanieś od 150 do 200 µL roztworu NBT na każdy preparat, używając końcówki pipety do równomiernego rozprowadzenia płynu na wszystkich przekrojach. Inkubuj preparaty przez 40 minut w temperaturze 37 °C, po czym usuń nadmiar roztworu z płytek. Przemyj preparaty cztery razy w PBS, po 10 minut za każdym razem.

Odwodnij preparaty na szkiełkach przez dwie minuty każdy w kolejnych stężeniach etanolu: 70%, 70%, 95%, 95% oraz 99,5%. Na koniec pozostaw preparaty na kolejne 10 minut w dodatkowym kroku z 99,5% etanolu. Umieść szkiełka w ksylenie na 10 minut, zamontuj przy użyciu LAN i nałóż szkiełka zakrywające.

Pozostawić preparaty do wyschnięcia przez noc lub co najmniej od jednej do dwóch godzin w wentylowanym pomieszczeniu. Przekroje mózgu myszy typu dzikiego oraz myszy z przedwczesnym starzeniem MT.DNA Mutator zostały sekwencyjnie znakowane pod kątem aktywności COX i SDH.

W hipokampie myszy typu dzikiego widoczna jest prawidłowa aktywność Cox, wskazana przez ciemnobrązowe barwienie. Niedobory Cox, objawiające się niebieskim barwieniem, wykazano w hipokampie myszy MT DNA mutator w 12. i 46. tygodniu. W 46. tygodniu życia u myszy M-T-D-N-A mutator odnotowano dalszy spadek aktywności Cox, co sugeruje rozległe nasilenie dysfunkcji łańcucha oddechowego.

Niewystarczające czasy inkubacji wynoszące 10 i 25 minut doprowadziły do zmniejszenia osadzania brązowego produktu reakcji DAB. Skrócone czasy inkubacji pozwoliły na powstanie niebieskiego produktu końcowego Forana podczas inkubacji SDH, co błędnie sugerowało obecność komórek z niedoborami COX. Przesunięcie szkiełek podczas inkubacji COX również spowodowało nieprawidłowe tworzenie i osadzanie produktu reakcji DAB.

Chociaż aktywności COX i SDH mogą być znakowane indywidualnie, jak pokazano tutaj, znakowanie sekwencyjne okazało się korzystne w lokalizacji komórek z dysfunkcją mitochondriów. Przykład kontroli specyficzności dla aktywności COX i SDH w mózgu myszy typu dzikiego wykazuje brak znakowania. Należy pamiętać, że praca z odczynnikami w protokole podwójnego znakowania COX i SDH jest niezwykle niebezpieczna, dlatego przy każdym wykonaniu tego testu należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie odpowiedniej odzieży laboratoryjnej i maski, praca pod dygestorium chemicznym oraz właściwa utylizacja medium inkubacyjnego.