Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest bezpośrednie i wyłączne wyprowadzenie potomstwa neuronalnego z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu indukcji cząsteczkami małocząsteczkowymi. Osiąga się to poprzez dodanie kwasu retinowego do niedróżnicujących się komórek utrzymywanych w określonych warunkach. Następnie proces różnicowania jest kontynuowany poprzez odłączenie komórek w kulturze zawiesinowej, w której tworzą one pływające skupiska komórkowe zwane neuroblastami.

Jeśli neuroblastom pozwoli się przytwierdzić do płytki hodowlanej w medium do różnicowania neuronów, wykształcą one cechy dojrzałych neuronów. W końcowym etapie można zastosować immunofluorescencję oraz mikroskopię dekonwolucyjną lub konfokalną, aby wykazać wpływ traktowania kwasem retinowym na morfologię i ekspresję markerów w traktowanych ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych. W innych technikach tylko niewielka frakcja komórek przyjmuje fenotyp neuronalny, podczas gdy nasza metoda pozwala na dobrze kontrolowaną i wydajną indukcję pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych wyłącznie w kierunku linii neuronalnej poprzez proste dostarczenie małych cząsteczek.

Podczas przygotowywania roztworów stokowych należy zwrócić uwagę na kilka kwestii. Należy pamiętać o powolnym rozmrażaniu matrigelu oraz ludzkiej lamininy z temperatury -80 °C do 4 °C przez noc; pożywki należy przechowywać w temperaturze 4 °C i zawsze ogrzewać je do 37 °C przed użyciem. Ponadto, podczas przygotowywania pożywki dla ludzkich ESL, niektóre suplementy dodaje się bezpośrednio przed zastosowaniem.

Należą do nich BFGF, kwas askorbinowy, aktywna insulina ludzka w A oraz transferyna. Następnie, bezpośrednio przed powlekaniem płytek, należy przygotować roztwory robocze Matrigel lub lamininy ludzkiej. Po przygotowaniu płytek do hodowli tkankowej wstępnie powleczonych żelatyną, należy inkubować je w temperaturze 37°C w 5% CO2.

Żelatynę można zastąpić roztworem roboczym matrigelu lub lamininy. Płytki należy pokryć, inkubując je przez noc w temperaturze 4 °C. Należy pozwolić koloniom ludzkich komórek ES rosnąć przez okres od pięciu do siedmiu dni, a następnie przygotować je do pasażowania.

Należy wybrać kolonie, w których ponad 75% stanowią niedróżnicowane ludzkie komórki ES; są one zazwyczaj lekko mętne, o wyraźnych krawędziach i zawierają skupiska komórek. Sygnałem rozpoczęcia różnicowania są zazwyczaj kolonie białe, zawierające głównie komórki zróżnicowane, które zazwyczaj wydają się przejrzyste. Nie należy wybierać kolonii białych ani przejrzystych.

Podnieś płytki pod światło i za pomocą markera obrysuj lekko mętne kolonie na dnie płytek. Używając krawędzi sterylnego końcówki pipety P2, oddziel otaczającą warstwę fibroblastów od kolonii ludzkich komórek ES. Następnie usuń otaczające komórki fibroblastów, a także wszystkie zróżnicowane części kolonii.

Teraz odessaj stare pożywkę zawierającą ododerwane zróżnicowane komórki. Następnie w każdym dołku przepłucz niezróżnicowane komórki raz pożywką dla ludzkich komórek es E pozbawioną BFGF, a następnie dodaj trzy mililitry świeżej pożywki ESL dla ludzi zawierającej B-F-G-F-B-F-G-F, która jest dodawana do świeżej pożywki bezpośrednio przed użyciem. Teraz za pomocą sterylnej końcówki do pipety P 2 podziel kolonie na małe kawałki i oderwij je od płytki.

Przenieś oddzielone fragmenty kolonii wraz z pożywką do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Pobierz dodatkowy 1 ml pożywki do wypłukania każdej studzienki.

Komórki są teraz gotowe do dalszej dyferencjacji z wykorzystaniem małych cząsteczek. Należy rozpocząć od ogrzania świeżo pokrytych płytek do 37 °C. Odessać roztwór pokrywający z płytek i dodać do każdej studni 4 mL pożywki zawierającej fragmenty kolonii, a następnie ostrożnie przenieść płytki do inkubatora, unikając ich wstrząsania.

Nie należy niepokoić płytek, aby umożliwić zasiedlenie komórek. Po trzech dniach inkubacji przygotować nową pożywkę zawierającą kwas omikowy. Następnie usunąć większość starej pożywki, pozostawiając jej tyle, aby komórki pozostały zanurzone.

Nie wolno dopuścić do wyschnięcia komórek w każdej studni. Należy dodać 4 mL świeżej pożywki do ludzkich komórek ES z bFGF i kwasem retinowym. Pożywkę należy wymieniać co drugi dzień, pozwalając na wzrost kolonii ludzkich komórek ES traktowanych kwasem retinowym.

Po siedmiu lub ośmiu dniach komórki przejdą zmiany morfologiczne w duże komórki zróżnicowane. Następnie należy przystąpić do przygotowania hodowli zawiesinowej; aby ją rozpocząć, należy oddzielić kolonie ESL od komórek, które uległy spontanicznemu zróżnicowaniu i zmigrowały, tworząc warstwę fibroblastów. Należy zastosować wspomnianą wcześniej technikę z użyciem sterylnego końcówki pipety, a następnie odessać stare medium zawierające pływające, oddzielone komórki fibroblastów.

Przemyj komórki raz pożywką HESC i zawieś je ponownie w trzech mililitrach pożywki HESC. Następnie, używając sterylnego końcówki do pipety P2, potnij kolonie na małe fragmenty i oddziel je od płytki.

Przenieś pożywkę z oderwanymi koloniami do jednej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów. Przepłucz dołki jednym mililitrem pożywki i dodaj płuczkę do wspólnej puli. Następnie odnieś aliquoty po cztery mililitry połączonych komórek do każdego dołka płytki sześciodołkowej o ultraniskiej adhezji (ultra-low attachment) na cztery do pięciu dni, przechowując płytkę w inkubatorze.

W tym czasie utworzą się pływające skupiska komórkowe lub neuroblasty, co pozwoli na dalszy rozwój neuroblastów w kierunku bardziej dojrzałego fenotypu neuronalnego. Przenieść medium zawierające te komórki do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Następnie wirować komórki z prędkością 1 400 RPM przez pięć minut.

Odssać i zważyć jak największą ilość starego medium, a następnie dodać równą ilość świeżego medium NSC zawierającego VEGF, NT-3 oraz BDNF. Pomieszać komórki za pomocą pipetowania w celu uzyskania zawiesiny, a następnie rozdzielić po 4 mL zawiesiny do sześciu dołków płytki hodowlanych. Przenieść płytki do inkubatora z nawilżaniem w temperaturze 37 °C.

Neuroblasty pozostawia się na noc na płytkach hodowlanych w celu utworzenia hodowli 3D poprzez dodanie zawiesiny neuroblastów do Matrigelu lub lamininy ludzkiej. Macierz 3D polimeryzuje w temperaturze 37 °C. Pożywkę należy wymieniać co drugi dzień.

W ciągu dwóch tygodni pojawią się rozległe sieci neuronów posiadających neuryty oraz komórki pigmentowe; kwas retinowy okazuje się wystarczający, aby indukować przejście ludzkich komórek ES utrzymywanych w zdefiniowanym systemie hodowlanym ze stanu pluripotencji wyłącznie w stronę fenotypu neuroepidermalnego. Po wystawieniu nieróżnicowanych ludzkich komórek ES na działanie kwasu retinowego, wszystkie komórki w kolonii uległy zmianom morfologicznym, przekształcając się w duże komórki zróżnicowane, które przestały wyrażać marker związany z pluripotencją OCT four. Komórki zaczęły również wyrażać różne markery związane z neuroektodermą, takie jak HNK one a, P two oraz TRKC.

Te duże zróżnicowane komórki nadal się namnażały, a kolonie zwiększały swoją wielkość, spontanicznie wykazując ekspresję wczesnego markera neuronalnego beta three tubulin. Bardziej dojrzały marker neuronalny map two zaczął pojawiać się w obszarach kolonii, w których komórki uległy spiętrzeniu. Równocześnie z pojawieniem się komórek neuroektodermalnych, czynnik transkrypcyjny specyficzny dla neuronów NER one, zaangażowany w różnicowanie neuronów dopaminergicznych i aktywację genu tyrozynowej hydroksylazy, przemieścił się do jądra komórkowego.

Po odłączeniu, ludzkie komórki ES traktowane kwasem retinowym utworzyły neuroblasty w hodowli zawiesinowej po usunięciu podstawowego FGF, a po umożliwieniu neuroblastom przytwierdzenia do płytki hodowlanej tkanek, zaczęły pojawiać się rozległe sieci neuronów z wypustkami oraz komórek pigmentowych, typowe dla OUN, przy drastycznym wzroście wydajności, i mogły być hodowane przez ponad trzy miesiące. Te pochodne z ludzkich komórek ES komórki neuronalne wykazywały ekspresję beta three tubulin w porównaniu do spontanicznej różnicowania wieloliniowego komórek bez traktowania kwasem retinowym i koekspresję map two. Po opanowaniu, technika ta może być wykorzystana do jednorodnego generowania progenitorów neuronalnych i komórek neuronalnych z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w ciągu około czterech tygodni, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo.

Należy pamiętać, że praca z ludzkimi komórkami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego przed przystąpieniem do tej procedury zawsze należy podjąć środki ostrożności, takie jak upewnienie się, że linie komórkowe są wolne od patogenów i mykoplazm.