Mapowanie heterogeniczności ekspresji białek w guzach z wykorzystaniem ilościowej immunofluorescencji
25 października 2011
W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę ilościowego określania heterogeniczności molekularnej w przekrojach histologicznych materiału nowotworowego z wykorzystaniem ilościowej immunofluorescencji, analizy obrazu oraz statystycznego miernika heterogeniczności. Metoda ta jest przeznaczona do zastosowania w opracowywaniu i analizie klinicznych biomarkerów.
Ogólnym celem następującego eksperymentu jest dokładne określenie ilościowej ekspresji biomarkerów w całych przekrojach tkanek nowotworowych człowieka, aby przypisać wartość numeryczną stopniowi heterogeniczności ekspresji białek. Osiąga się to poprzez najpierw zeskanowanie immunofluorescencyjnie znakowanych przekrojów tkanki nowotworowej przy użyciu fluorescencyjnego skanera do całych preparatów. Następnie do oceny wybierane są obszary zainteresowania w obrębie guza.
Następnie ekspresję badanego białka w obszarach nacieku nowotworowego określa się ilościowo przy użyciu zautomatyzowanego systemu analizy obrazów aqua analysis. Ostatecznie metodę tę można wykorzystać do mapowania ekspresji biomarkerów w tkance nowotworowej, która często wykazuje dużą heterogenność w obrębie przekroju tkankowego. Główną zaletą stosowania tych technik w porównaniu z metodami tradycyjnymi, takimi jak immunohistochemia z wykorzystaniem barwników i odczynników wizualizacji metrycznej, jest fakt, że immunofluorescencja jest bardziej ilościowa i czulsza.
Połączenie tych metod analitycznych ze skanowaniem immunofluorescencyjnym całych przekrojów umożliwia precyzyjne mapowanie subtelnych różnic w ekspresji biomarkerów w obrębie tkanek. Procedury te prezentuje po raz pierwszy Mark Gustafson, dyrektor operacyjny laboratorium Histo RX. Po wykonaniu mikrotomii biopsji tkanki nowotworowej oraz barwieniu immunofluorescencyjnym preparatu w celu wykazania ekspresji interesujących biomarkerów, należy umieścić do pięciu szkiełek z zabarwionymi przekrojami w kasecie skanera do preparatów.
Następnie, korzystając z interfejsu w konsoli skanera, dla każdego preparatu należy zaznaczyć obszar obejmujący całą tkankę na szkiełku, niezależnie od wzoru barwienia lub innych obserwowalnych cech próbki. Następnie, za pomocą konsoli skanera, należy wybrać obszar tkanki do oceny, najlepiej w obrębie regionu nowotworowego, aby zapewnić jak najpełniejszą reprezentatywność.
Używając funkcji automatycznej ekspozycji w konsoli skanera, należy określić czas ekspozycji dla każdego kanału oraz ostrość obrazu; za pomocą niebieskiego rombu na obrazie w konsoli skanera należy wybrać dodatkowy obszar oddalony od tkanki, lecz wciąż znajdujący się w obrębie preparatu pod szkiełkiem podstawowym, aby zdefiniować obszar tła, w którym zostaną pozyskane obrazy do korekcji pola płaskiego. Dla każdego filtra należy dodać punkty ostrości w obszarze tkanki, reprezentowane przez żółte kwadraty, aby zoptymalizować akwizycję obrazu. Jeśli obrazy wykazują wysokie tło lub inne artefakty, należy przenieść obszar obrazowania i ponownie pozyskać obrazy.
Następnie tkanka zostaje zeskanowana, a uzyskane cyfrowe obrazy preparatów są automatycznie przesyłane do bazy danych Aperio spectrum. Kliknij dwukrotnie miniaturę obrazu w programie spectrum, aby wybrać z listy cyfrowych preparatów w bazie danych spectrum preparat do analizy. Następnie, korzystając z dołączonego obrazu z adnotacjami h i D, zaznacz obszar zainteresowania na obrazie fluorescencyjnym.
Na pojedynczej próbce można zaznaczyć wiele obszarów zainteresowania, wyznaczając je za pomocą poszczególnych okręgów. Adnotowane obrazy są automatycznie zapisywane w bazie danych widm. Teraz wybierz Analyze z paska menu u góry ekranu; gdy pojawi się okno analizy, wybierz histo RX aqua analysis z menu rozwijanego.
Po przygotowaniu do rozpoczęcia należy nacisnąć przycisk analizy. Na pasku zadań systemu Windows pojawi się zminimalizowane okno konsoli wyświetlające postęp przesyłania obrazów z bazy danych Spectrum na komputer lokalny. Po przesłaniu danych zostanie uruchomiona analiza aqua w celu wygenerowania wyniku aqua przy użyciu algorytmu punktacji aqua bez nadzoru, opartego na klastrowaniu danych pierwszego progu próbki, czyli sygnału obrazu pancytokeratyny powyżej sygnału obrazu tła. Pozwoli to na wykorzystanie pikseli do zdefiniowania maski guza, która może być następnie użyta do dalszych obliczeń.
Wykorzystaj piksele o wysokiej ekspresji pankytokeratyny do zdefiniowania również obszarów cytoplazmatycznych lub pozajądrowych komórek nowotworowych. Jak widać tutaj, piksele z silnym sygnałem w kanale DPI, które znajdują się w obrębie maski nowotworu, są identyfikowane jako jądrowe. Jeśli podczas przeglądu zidentyfikowane zostaną pola nienadające się do oceny z powodu artefaktów próbki lub obrazowania, pola te zostaną wykluczone z oceny, co również spowoduje końcowy wynik negatywny.
Wyniki oceny aqua są przedstawione w formie tabeli wyników przypisanych do każdego fragmentu o wymiarach 512 na 512 pikseli w obszarze zainteresowania w obrębie całej próbki przekroju tkanki, którą można zapisać i wykorzystać do późniejszej analizy statystycznej. Te mikrofotografie barwione hematoksyliną i eozyną pokazują, jak różne obszary tego samego raka jajnika mogą wykazywać zmienną morfologię. Powiększenie w prawym górnym rogu rysunku B uwydatnia komórki z przejaśnieniami cytoplazmatycznymi oraz lity wzorzec wzrostu w górnej części guza.
Dolna część tkanki powiększona w prawym dolnym fragmencie Rysunku C wykazuje jednak bardziej jednorodną eozynofilną cytoplazmę oraz brodawkowy wzorzec wzrostu. Tutaj, w panelach górnym i dolnym, przedstawiono odpowiednio mapy ciepła heterogeniczności ekspresji ER w przekroju tkanki raka jajnika przed i po leczeniu chemioterapią. Należy zwrócić uwagę na zmianę ze zmiennej ekspresji ER w całym przekroju, z obszarami zarówno wysokiej, jak i niskiej ekspresji na górnej rycini, na równomierny rozkład wysokiej ekspresji ER, zaznaczony kolorem czerwonym na dolnej rycini.
Numeryczna reprezentacja tej zmiany jest oznaczona po lewej stronie poprzez spadek indeksu Simpsona. Na tej rycinie ponownie przedstawiono mapy ciepła heterogeniczności HER two w przekroju tkankowym raka jajnika przed i po terapii, odpowiednio w panelu górnym i dolnym. Należy ponownie zwrócić uwagę na zmianę ze zmiennej ekspresji HER two w całym przekroju, z obszarami o wysokiej i niskiej ekspresji na górnej rycinie, do równomiernego rozkładu wysokiej ekspresji HER two na rycinie dolnej.
Ponownie zauważalny jest spadek indeksu Simpsona. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że jakość danych generowanych przez analizę obliczeniową zależy bezpośrednio od jakości barwienia, która musi stać na wysokim poziomie technicznym.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę ilościowego określania heterogeniczności molekularnej w histologicznych przekrojach guza z wykorzystaniem ilościowej immunofluorescencji oraz analizy obrazu. Podejście to ma na celu usprawnienie opracowywania klinicznych biomarkerów poprzez dostarczenie statystycznej miary heterogeniczności ekspresji białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Onkologia
- Immunologia
Wstęp
- Kwantyfikacja ekspresji biomarkerów jest kluczowa w badaniach nad nowotworami.
- Tradycyjne metody, takie jak immunohistochemia, mają ograniczenia w zakresie czułości i kwantyfikacji.
- Immunofluorescencja oferuje bardziej ilościowe podejście do oceny ekspresji białek.
- Zrozumienie heterogeniczności guzów może pomóc w opracowaniu strategii leczenia.
Cel badania
- Aby dokładnie określić poziom ekspresji biomarkerów w całych przekrojach tkankowych.
- Aby przypisać wartości liczbowe do stopnia heterogeniczności ekspresji białek.
- Aby usprawnić mapowanie ekspresji biomarkerów w heterogenicznych tkankach nowotworowych.
Zastosowane metody
- Skanowanie preparatów tkankowych znakowanych immunofluorescencyjnie za pomocą skanera całych preparatów.
- Wybór obszarów zainteresowania w obrębie guza do oceny.
- Kwantyfikacja ekspresji białek z wykorzystaniem zautomatyzowanego systemu analizy obrazu aqua analysis.
- Generowanie map ciepła heterogeniczności w celu wizualizacji zmian w ekspresji biomarkerów.
Główne wyniki
- Wykazano zdolność do mapowania zmienności ekspresji biomarkerów w tkankach nowotworowych.
- Przedstawiono zmiany w wzorcach ekspresji przed i po zastosowaniu chemioterapii.
- Przeprowadzono ilościową ocenę heterogeniczności z wykorzystaniem indeksu Simpsona.
- Wskazano na zalety immunofluorescencji w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
Wnioski
- Metoda ta pogłębia zrozumienie heterogeniczności biomarkerów w guzach nowotworowych.
- Oferuje ona bardziej czułe i ilościowe podejście w zastosowaniach klinicznych.
- Technika ta może wspomóc opracowanie terapii celowanych w oparciu o ekspresję biomarkerów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe określanie heterogeniczności przestrzennej ekspresji białek w guzach wypełnia istotną lukę w procesie opracowywania leków opartych na biomarkerach, w którym tradycyjne metody analizy masowej (bulk) lub półilościowe maskują zmienność na poziomie subpopulacji, mogąca wpływać na odpowiedź terapeutyczną oraz oporność. Dzięki dostarczeniu numerycznej, rozdzielczej przestrzennie miary rozkładu biomarkerów, metoda ta umożliwia bardziej precyzyjną stratyfikację pacjentów oraz wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w procesach walidacji celów i opracowywania testów analitycznych. Jej zastosowanie w badaniu ER i HER2 w raku jajnika wykazuje bezpośrednią przydatność w przewidywaniu odpowiedzi na terapię endokrynną i celowaną, dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu programów przedklinicznych i wczesnych badań klinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie heterogeniczności ekspresji biomarkerów jako zmiennej niezależnej w badaniach walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu, wykazując, czy obserwowane poziomy biomarkerów odzwierciedlają jednorodne zaangażowanie celu, czy też są zaburzone przez zmienność wewnątrzguza.
- Wartość prognostyczna: Usprawnia selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację celów o jednolitych wzorcach ekspresji, które z większym prawdopodobieństwem zapewnią spójne odpowiedzi na lek w różnych obszarach guza.
Przesiew i opracowanie analizy
- Gotowość do analizy: Generuje zwalidowane, rozdzielone przestrzennie mapy ekspresji białek, które służą jako ilościowe punkty odniesienia do opracowywania i standaryzacji testów opartych na immunofluorescence.
- Powtarzalność: Wykorzystuje zautomatyzowane kafelkowanie (tiling) oraz punktację AQUA w celu zminimalizowania błędu obserwatora i zapewnienia spójnej kwantyfikacji w różnych sekcjach tkanek i seriach eksperymentalnych.
- Skalowalność przesiewania: Generuje dane na poziomie kafelków kompatybilne z przepływami pracy analizy wysokotreściowej (high-content analysis), co umożliwia skalowalną ocenę wpływu związków na rozkład biomarkerów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy pomiary heterogeniczności z fazy odkrywczej z walidacją przedkliniczną, dostarczając systemu istotnego dla danej choroby do oceny stabilności biomarkerów przed i po interwencji terapeutycznej.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Kwantyfikuje zmiany w heterogeniczności ekspresji ER i HER2 przed i po chemioterapii, oferując biomarker prognostyczny dla fenotypowych przesunięć indukowanych terapią.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez identyfikację, czy efekty terapeutyczne są jednorodne czy selektywne, co ogranicza ryzyko niepowodzeń w późnych etapach z powodu nieprzewidzianych, opornych subklonów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną, szczególnie w przypadku terapii opartych na biomarkerach, gdzie przestrzenne wzorce ekspresji wpływają na skuteczność leku i mechanizmy oporności.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez, umożliwiając kwantyfikację heterogeniczności ekspresji białek jako zmiennej w badaniach mechanistycznych biologii nowotworów i szlaków sygnalizacyjnych.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy danych ilościowych (wyniki AQUA na każdą płytkę), co ułatwia powtarzalne przesiewanie związków w heterogenicznych modelach nowotworowych.
- Analityka: Generuje mapy ciepła heterogeniczności oraz wyniki oparte na indeksie Simpsona, dostarczając metryk statystycznych do porównywania warunków i śledzenia zmian ekspresji w czasie lub w trakcie leczenia.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez wykazanie, w jaki sposób ekspresja biomarkerów zmienia się po leczeniu, co pozwala na opracowanie strategii monitorowania farmakodynamicznego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania i analizy, możliwą do zastosowania w różnych typach nowotworów i dla różnych biomarkerów, co ogranicza redundantne opracowywanie metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie istotności biomarkera poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej wynikającej z niemierzalnej heterogeniczności wewnątrznowotworowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia znormalizowaną, powtarzalną kwantyfikację dzięki zautomatyzowanej analizie obrazu i zwalidowanym protokołom barwienia.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wcześniejszą identyfikację biomarkerów o jednorodnej ekspresji, co ogranicza inwestycje w cele, które mogą okazać się nieskuteczne z powodu heterogeniczności dostępności celu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez wskazanie biomarkerów, w których heterogeniczność koreluje ze złym rokowaniem lub zmienną odpowiedzią na leczenie.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w barwieniu immunofluorescencyjnym, skanowaniu całych preparatów oraz analizie obrazów w oparciu o metodę AQUA.
- Zależy od wysokiej jakości multipleksowego barwienia immunofluorescencyjnego oraz skanera fluorescencyjnego do całych preparatów z możliwością rozdzielania widm (spectral unmixing).
- Wymaga standaryzacji protokołów wyboru obszarów zainteresowania (ROI) oraz korekcji tła w celu zapewnienia porównywalności wyników między laboratoriami.
- Adaptacja do alternatywnych systemów modelowych (np. ksenograftów, organoidów) wymaga walidacji maskowania nabłonka oraz parametrów segmentacji sygnału.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zależność od specyficzności przeciwciał oraz stosunku sygnału do szumu, co może wpływać na dokładność ilościowego oznaczania rzadko występujących celów.
