Uproszczona technika wytwarzania modelu rany niedokrwiennej

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest umożliwienie tworzenia ran niedokrwiennych nie tylko u zdrowych królików, ale także u królików o obniżonej odporności, takich jak zwierzęta w starszym wieku lub z cukrzycą. Wszystkie obecnie stosowane techniki tworzenia ran niedokrwiennych są wysoce inwazyjne i do tej pory żadna z nich nie mogła być zastosowana u zwierząt z cukrzycą. Niniejsza procedura wykorzystuje małoinwazyjną operację, która rozpoczyna się od wykonania trzech niewielkich nacięć skóry nad trzema pęczkami naczyniowymi.

Kolejnym krokiem jest wyizolowanie i zabezpieczenie żyły centralnej oraz wiązki naczyniowej grzebieniowej, tak aby krążenie krwi w małżowinie usznej zostało ograniczone, ale nie całkowicie przerwane. Na koniec pozostałe naczynia, nerwy i tkanki podskórne zostają przerwane lub podwiązane poprzez nacięcia skórne. Niedokrwienie ucha potwierdza się poprzez brak tętna tętniczego, wygląd ucha, różnicę temperatur oraz nasycenie tlenem tkanki podskórnej.

Ta małoinwazyjna operacja może wydawać się trudna do wykonania, ale w rzeczywistości jest bardzo prosta. Główną zaletą tej techniki jest minimalny stopień naruszenia skóry. Od czasu pierwszej publikacji tej metody w 2007 roku otrzymaliśmy wiele pytań.

Od tego czasu dodatkowo uprościliśmy tę procedurę. Aby jeszcze bardziej ułatwić jej wykonanie bez użycia mikroskopu, należy rozpocząć od zważenia wybranego królika, a następnie znieczulić zwierzę, stosując mieszaninę ketaminy i ksylazyny. Monitorując oznaki życiowe królika, na stronie grzbietowej można zidentyfikować trzy pęczki naczyniowe zaopatrujące ucho.

Jest to pęczek centralny, który jest największy i posiada odgałęzienia łączące się z innymi naczyniami, pęczek boczny, w którym tętnica jest zazwyczaj bardzo mała lub nieobecna, oraz pęczek czaszkowy. Po stronie brzusznej dystalna część skóry nie jest ukrwiona przez naczynia proksymalne.

Zamiast tego, pęczki naczyń na grzbietowej stronie ucha mają liczne gałęzie penetrujące chrząstkę, aby zapewnić dopływ krwi do dystalnej skóry brzusznej. U niektórych królików na stronie brzusznej występuje również bardzo małe naczynie podskórne, które dostarcza krew do nie więcej niż jednej trzeciej skóry brzusznej. W przypadku otwartego okrężnego nacięcia skóry, z nacięcia brzusznego praktycznie nie występuje krwawienie.

Przed przystąpieniem do procedury należy upewnić się, że królik nie reaguje na bodźce bólowe, sprawdzając odruch uciśnięcia palca oraz odruch oka, a następnie zabezpieczyć oczy zwierzęcia, nakładając maść ziarna sztucznych łez. Podczas operacji należy utrzymywać ciepłotę ciała królika za pomocą podkładki grzewczej. Następnie obie małżowiny uszne oraz skórę wokół nich należy oczyścić Betadyną i alkoholem, a następnie założyć pole operacyjne tak, aby odsłonięte pozostały jedynie oba uszy.

Jedno ucho zostanie poddane niedokrwieniu, podczas gdy drugie będzie służyć jako kontrola. Instrumenty użyte podczas operacji to skalpel z ostrzem nr 15, dwie pary pęset – jedna do skóry, a druga do pozostałych tkanek miękkich. Trzy kleszczyki naczyniowe (mosquite), jedna lub dwie pary zakrzywionych mikronoareczek, jedna para małych nożyczek do przecinania szwów i twardych tkanek, igłotrzymacz oraz zestaw sterylizowanych wycinaków ze stali nierdzewnej.

Operację rozpocznij od zidentyfikowania trzech szypuł naczyniowych na podstawie przebiegu tętnic i żył. Używając ostrza nr 15, wykonaj ostrożnie jedno pionowe nacięcie skóry na środkowej szypule naczyniowej.

Wyizoluj żyłę główną z otaczających ją tkanek i zabezpiecz ją. Ten etap obejmuje otoczenie żyły głównej w celu jej odsunięcia.

Uwolnij poprzez dysekcję nerw centralny. Zazwyczaj znajduje się on po stronie przyśrodkowej żyły. Nerw należy przeciąć nożyczkami.

Wypreparuj tętnicę centralną. Zazwyczaj znajduje się ona po stronie kranialnej i głębiej niż żyła; podwiąż tętnicę, a następnie ją przetnij. Oczyść tkanki wokół żyły centralnej nad chrząstką małżowiny usznej.

Drugie cięcie skóry wykonuje się nad wiązką naczyniowo-nerwową jajowodu. Aby zachować tę wiązkę, naczynia zostają wypreparowane i opatrzone pętlą w celu ich ochrony.

Jest to szczególnie przydatne, gdy żyła jest duża, jak w przypadku tego królika. Wykonaj tunel pomiędzy tym miejscem a pierwszym nacięciem. Przetnij tkanki podskórne nad chrząstką.

Trzecie nacięcie skóry wykonuje się nad pęczkiem czaszkowym. Cały pęczek zostaje podwiązany i oddzielony. Skóra nad trzecim pęczkiem zostaje przecięta.

Żyła ta znajduje się bardzo blisko skóry, dlatego nie należy naciąć tkanek zbyt głęboko. Następnie cały pęczek naczyniowy zostaje wypreparowany, podwiązany i oddzielony. Za pomocą noża i nożyczek należy wykonać tunel podskórny.

Trzy nacięcia przecinają wszystkie tkanki podskórne, mięśnie, nerwy i małe odgałęzienia naczyniowe. Należy zastosować dodatkowe rozcięcia ostre i tępe, aby oczyścić podstawę, pozostawiając odsłoniętą chrząstkę o szerokości około 5 do 10 milimetrów. Krwawienie można opanować poprzez ucisk gazikiem.

Elektrokoagulacja nie jest konieczna. Skóra wewnątrz ucha nie jest nacinana, ponieważ nie jest silnie ukrwiona. Kluczowym aspektem tej procedury jest zapewnienie odpowiedniej preparacji tunelu podskórnego przy jednoczesnej ochronie naczyń krwionośnych.

Procedura ta nie powinna być trudna. Po uzyskaniu hemostazy trzy nacięcia skóry zamyka się za pomocą szwów o rozmiarze 4-0 lub 5-0, a następnie ponownie sprawdza, czy nacięcia są prawidłowo zamknięte i czy nie występuje krwawienie. W celu przeprowadzenia testów leków na rany, na brzusznej stronie każdego ucha można wykonać cztery okrągłe rany pełnej grubości skóry za pomocą 6 mm stalowego biopsjera.

Odległość między ranami wynosi co najmniej 20 do 30 milimetrów. Skórę oraz rozprzestrzeń chrząstki w obrębie otworu potrepanacyjnego usuwa się, dbając o to, aby nie uszkodzić chrząstki. Po wykonaniu ran w obu uszach należy tymczasowo przykryć je gazą i przenieść królika do pomieszczenia zabiegowego w celu aplikacji leku.

Po oczyszczeniu ran z wszelkich skrzepów krwi, należy podać leki testowe oraz kontrolne. Rany pokrywa się opatrunkiem okluzyjnym, aby zapobiec wysychaniu. Przy porównywaniu dwóch leków, każdy z nich należy zastosować zarówno w ranie proksymalnej, jak i dystalnej.

Pozwala to kontrolować różnice w tempie gojenia się ran w dystalnej i proksymalnej części ucha po operacji. Niedokrwione ucho zazwyczaj staje się chłodne i sinieje, z jednoczesnym zmniejszeniem czucia dystalnie od miejsca nacięcia. Przez kilka dni może wystąpić lekki obrzęk, który jednak ustępuje samoistnie i nie wymaga leczenia.

Tętno w tętnicy głównej jest nieobecne. Ruchy małżowiny usznej są ograniczone, ale nie całkowicie zniesione, ponieważ niektóre mięśnie nadal są przytwierdzone do podstawy ucha. Jeśli tunel został wykonany prawidłowo, między nacięciami widoczne jest wyraźne wgłębienie.

Plaster z fentanylem zostaje przyklejony do skóry pleców w celu uśmierzenia ewentualnego bólu pooperacyjnego. Temperatura skóry jest mierzona codziennie w każdym uchu za pomocą termometru. Krążenie krwi w uchu jest mierzone przy użyciu transkutaneousnego miernika napięcia tlenu lub laserowego dopplerowskiego miernika przepływu.

Po tygodniu można usunąć szwy z nacięć skóry z 2007 roku. Procedura ta została zastosowana u ponad 70 królików. Obejmuje to 23 króliki z cukrzycą oraz cztery króliki w wieku podeszłym.

Różnice temperatur pomiędzy uchem nie niedokrwionym a niedokrwionym mieściły się w przedziale od 1 do 10 °C, przy czym u większości królików wynosiły one od 2 do 6 °C. Różnica temperatur była wyższa w pierwszych dniach po operacji i stopniowo malała po 15. dniu, jednak była nadal utrzymywana po upływie jednego miesiąca. Z każdego ucha pobrano sześć próbek tkanek, a zawartość fosforanów wysokenergetycznych, zarówno TP, jak i energię całkowitą, zmierzono za pomocą metody HPLC.

Stężenia były wyższe w uszach prawidłowych niż w uszach niedokrwionych. Czas gojenia ran był zawsze dłuższy w uchu niedokrwionym niż w uchu niedokrwionym u zwierząt niediabetycznych i diabetycznych w grupie 15 królików niediabetycznych. Średni czas gojenia wynosił 17,8 dnia w uchu niedokrwionym w porównaniu do 21,8 dnia w uchu niedokrwionym.

U zwierząt z cukrzycą trwającą od 10 do 12 miesięcy średni czas gojenia wynosił 18,3 dnia w przypadku ucha nieischemicznego w porównaniu do 29,1 dnia w przypadku ucha ischemicznego. U wszystkich zwierząt, w tym u królików z cukrzycą, nacięcia skóry goiły się prawidłowo, bez żadnych powikłań. W przypadku cukrzycy trwającej 24 miesiące rany brzuszne wykazują większą tendencję do infekcji.

Ta cecha sprawia, że model jest bardziej zbliżony do ludzkich ran cukrzycowych. Próbka histologiczna wykazuje gojenie tunelu podskórnego, w którym brakuje mięśnia, a jego miejsce zajmują tkanki włókniste. Jednakże skóra pozostaje nienaruszona.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o humanitarnym traktowaniu zwierząt. Po opanowaniu tej techniki zabieg można przeprowadzić w czasie krótszym niż jedna godzina. Zastosowaliśmy tę technikę u ponad 70 królików, w tym u 23 królików z cukrzycą, bez żadnych powikłań, takich jak krwawienie czy infekcja.

Jest to bardzo bezpieczna procedura, jeśli postępuje się zgodnie z tym opisem. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania badawcze dotyczące np. wrzodów naczyniowych, odleżyn oraz neuropatii cukrzycowej, można zastosować inne metody, takie jak dodatkowe niedokrwienie, uszkodzenie nerwów i inokulacja bakteryjna.