Protokoły inokulacji pochwowej i pobierania próbek w eksperymentalnym modelu zapalenia pochwy wywołanego przez Candida u myszy
8 grudnia 2011
Opisano kluczowe techniki stosowane w ocenie zapalenia pochwy spowodowanego przez Candida w eksperymentalnym modelu zwierzęcym. Metody te pozwalają na szybkie pobranie wymazów z pochwy oraz limfocytów z drenujących węzłów chłonnych lędźwiowych. Techniki te mogą posłużyć do stworzenia modeli mysich innych chorób dolnych dróg rodnych u samic.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie konkretnych kwestii proceduralnych związanych z wykorzystaniem eksperymentalnego modelu zwierzęcego kandydozy pochwy w celu ilościowego określenia obciążenia grzybiczego w pochwie, a także wykorzystania komórek pochwy lub komórek limfatycznych w określonych testach, takich jak analizy immunologiczne i histologiczne. Zostanie to osiągnięte poprzez zaprezentowanie techniki inokulacji pochwy u myszy traktowanych estrogenem. Następnie, po uśmierceniu myszy, zostanie wykonane płukanie pochwy w celu odzyskania candida.
Następnie należy wyekstrahować tkankę pochwy i/lub drenażowe węzły chłonne pochwy. Płyn z płukania można poddać badaniu mikroskopowemu w celu wykazania obecności Candida związanej z komórkami nabłonka pochwy lub wysiać na agar w celu ilościowego oznaczenia obciążenia grzybiczego pochwy. Rozmaz frakcji komórkowej można również wykorzystać do barwienia komórek nabłonkowych i limfoidalnych.
Główną zaletą zaprezentowania tej techniki jest umożliwienie użytkownikom zwierzęcego modelu zapalenia pochwy przeprowadzania go w sposób najbardziej wydajny i efektywny. Kluczowe pytania, na które odpowiada ta metoda, dotyczą dziedziny zapalenia pochwy i ekologii; obejmują one kwestie takie jak odpowiedzi immunologiczne gospodarza, dystrybucja komórkowa, skuteczność leków, skuteczność immunoterapii, a także efekty immunizacji oraz demonstracja samej techniki. Dzisiaj doktorantka z mojego laboratorium, Junco Yano, przeprowadzi zakażenie myszy C. albicans trzy dni po podaniu iniekcji beta-estradiolu.
Zacznij od ustabilizowania myszy na płaskiej powierzchni gRED, aby zwierzę mogło się czegoś chwycić. Następnie chwyć nasadę ogona dwoma palcami i unieś biodra do góry tak, aby otwór pochwy był skierowany w Twoją stronę. Wprowadź końcówkę pipety na głębokość około pięciu milimetrów do światła pochwy i pobierz 20 µL zawiesiny inokulum.
Wykonaj ten krok tak szybko i delikatnie, jak to możliwe, aby zminimalizować stres u myszy. Po pożądanym czasie inkubacji uśmierć zwierzę zgodnie z protokołem obowiązującym w Twojej jednostce. Następnie, trzymając mysz dwoma palcami za nasadę ogona w pozycji skierowanej w dół, odsłoń otwór pochwy, aby umożliwić dostęp pipetą.
Wprowadź 100 µL sterylnego PBS do światła pochwy, a następnie wykonaj płukanie, powtarzając aspirację i mieszanie. Jeśli końcówka pipety zostanie zatkana komórkami, usuń je i kontynuuj płukanie pozostałym PBS. Płyn z płukania zbierz do probówki do mikrocentryfugi.
Po przeprowadzeniu procedury płukania pochwy, połóż mysz na grzbiecie i nasącz okolicę pachwin 70% ethanol. Za pomocą pęsety unieś ujście cewki moczowej do góry, aby odsłonić otwór pochwy. Wprowadź zakrzywioną pęsetę do światła pochwy i zlokalizuj szyjkę macicy, utrzymując ją pewnym uchwytem pęsety.
Wyciągnij szyjkę macicy przez jamę pochwy, wycinij pochwę u podstawy otworu pochwy, a następnie oddziel szyjkę macicy od pochwy za pomocą nożyczek chirurgicznych. Ponieważ tkanka pochwy uległa inwolucji, odwróć ją, aby zachować pierwotną orientację, lub rozetnij ją bocznie, tworząc płaski arkusz, w celu wycięcia węzłów chłonnych lędźwiowych przy zwierzęciu leżącym na grzbiecie. Nasącz brzuch 70% ethanol.
Wykonaj nacięcie boczne od dolnej części brzucha do klatki piersiowej i odsłoń narządy wewnętrzne, używając w obu dłoniach pęset. Przesuń jelita ku górze, aby odsłonić centralne naczynia krwionośne. Zlokalizuj żyłę główną dolną oraz aortę brzuszną.
Parę węzłów chłonnych lędźwiowych można zidentyfikować w sąsiedztwie aorty brzusznej, mniej więcej w połowie drogi między odejściem tętnic nerkowych a tętnicami biodrowymi wspólnymi. Węzły chłonne te można odróżnić od tkanki tłuszczowej po ich elastycznej teksturze oraz jaśniejszym i bardziej nieprzezroczystym kolorze. Są one również wyraźnie większe u zwierząt zainfekowanych w porównaniu do nieinokulowanych.
Węzły chłonne wycinano, umieszczając mikropincetę pod węzłem, a następnie delikatnie go unosząc, aby oddzielić go od otaczających tkanek. Po wycięciu tkanki węzły chłonne przenoszono na sterylne sito z drutu, umieszczone w sterylnej szklanej szalce Petri zawierającej około 10 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa. W celu izolacji komórek limfoidalnych należy odnieść się do protokołu pisemnego.
Frakcje komórkowe płynu z płukania pochwy u myszy inokulowanych co najmniej cztery dni wcześniej zazwyczaj składają się z komórek nabłonka pochwy oraz nacieków komórkowych, co pokazano tutaj w badaniu mikroskopowym w świeżym preparacie. Candida może zostać zidentyfikowana poprzez obecność PHA, a także drożdżaków. Tutaj przedstawiono barwione preparaty rozmazów płynu z płukania pochwy.
Wykorzystanie techniki cytologii szyjki macicy (Pap smear) do badania komórek nabłonkowych i naciekających leukocytów, wśród których komórkami głównymi są neutrofile, co można zidentyfikować po trójpłatowych jądrach. U myszy nieinokulowanych stwierdza się bardzo mało neutrofili lub ich całkowity brak. Rycina ta przedstawia przykład obciążenia grzybiczego pochwy.
Płyn z płukania pochwy jest pobierany w określonych punktach czasowych i poddawany hodowli w celu wyznaczenia liczby CFU. W tym przykładzie płyn pobrano w piątym dniu po inokulacji, poddano rozcieńczeniom seryjnym, wysiano na płytki i inkubowano przez 48 godzin. Następnie zliczono kolonie i obliczono obciążenie grzybicze pochwy; kolonizacja pochwy lub zakażenie candida utrzymuje się przez wiele tygodni u myszy inokulowanych i traktowanych estrogenem.
Podczas gdy u myszy inokulowanych, niepoddanych działaniu estrogenu, candida nie kolonizuje pochwy, mysze nieinokulowane, lecz traktowane estrogenem, pozostają ujemne w kierunku candida przez cały czas trwania badania. Dodatkowo, płukanie pochwy można przeprowadzić jednorazowo na osobnych myszach w każdym punkcie czasowym lub podłużnie u tych samych myszy w znieczuleniu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o bezpiecznym unieruchomieniu zwierząt, aby uniknąć urazów pochwy, oraz poświęcić czas niezbędny do dokładnego wypłukania, aby uzyskać precyzyjną wartość obciążenia grzybiczego pochwy podczas pobierania tkanek pochwy.
Użyj statycznego roztworu PBS, aby zapobiec ich odwodnieniu; należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić głównych żył i tętnic podczas usuwania węzłów chłonnych. Podczas przetwarzania komórek węzłów chłonnych należy trzymać je w lodzie lub w temperaturze 4°C w celu utrzymania żywotności komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wykorzystać eksperymentalny model mysi zapalenia pochwy wywołanego przez Candida, aby w sposób powtarzalny określić ilość grzybów w pochwie oraz wyciąć tkanki pochwy lub tkanki limfatyczne do specyficznych analiz immunologicznych lub histologicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje kluczowe techniki oceny zapalenia pochwy wywołanego przez Candida z wykorzystaniem eksperymentalnego modelu zwierzęcego. Opisane metody umożliwiają szybkie pobieranie wymazów z pochwy oraz limfocytów z drenujących węzłów chłonnych lędźwiowych, co może przyczynić się do opracowania modeli mysich dla innych schorzeń dolnych dróg rodnych u samic.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Mikrobiologia
- Immunologia
Wstęp
- Zapalenie pochwy spowodowane drożdżakami Candida jest powszechnym schorzeniem dotykającym żeński układ rozrodczy.
- Zrozumienie odpowiedzi immunologicznej jest kluczowe dla opracowania metod leczenia.
- Modele eksperymentalne pomagają w badaniu mechanizmów choroby.
- Kandydozę pochwy można ilościowo określić przy użyciu specyficznych testów.
Cel badania
- Zaprezentowanie technik proceduralnych służących do badania kandydozy pochwy.
- Ilościowe określenie obciążenia grzybiczego w pochwie w modelu eksperymentalnym.
- Wykorzystanie komórek pochwy i komórek limfatycznych w testach immunologicznych.
Zastosowane metody
- Technika inokulacji pochwowej u myszy traktowanych estrogenem.
- Płukanie pochwy w celu odzyskania Candida po uśmierceniu myszy.
- Ekstrakcja tkanki pochwy i drenujących węzłów chłonnych.
- Badanie mikroskopowe i wysiew płynu z płukania na agar.
Główne wyniki
- Skuteczne wyizolowanie Candida z płukania pochwy.
- Ilościowe oznaczenie obciążenia grzybiczego przy użyciu metody wysiewu na agar.
- Identyfikacja komórek nabłonkowych i limfoidalnych poprzez barwienie.
- Wykazanie wykonalności modelu do przyszłych badań.
Wnioski
- Opisane techniki stanowią solidną metodę badania kandydozy pochwy.
- Model ten można dostosować do innych schorzeń dolnych dróg rodnych u kobiet.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu zgłębienia odpowiedzi immunologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Experimentalny mysi model zapalenia pochwy wywołanego przez Candida stanowi solidną platformę do ilościowego oznaczania obciążenia grzybiczego w pochwie oraz oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza w kontrolowanym systemie odpowiadającym przebiegowi choroby. Model ten umożliwia powtarzalną ocenę dynamiki zakażenia i punktów końcowych immunologicznych, wspierając wczesne odkrycia oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego dla kandydatów na leki przeciwgrzybicze i immunoterapeutyczne. Jego zgodność translacyjna z właściwościami zakażeń u ludzi zwiększa pewność prognostyczną w przypadku decyzji dotyczących portfela badań przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie oddziaływań między gospodarzem a patogenem oraz mechanizmów odpowiedzi immunologicznej w kontekście fizjologicznie istotnym.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez kwantyfikację infekcji i infiltracji komórek odpornościowych bez zakłóceń wynikających z immunosupresji.
- Ułatwia analizę mechanistyczną w celu zmniejszenia ryzyka w strategiach przeciwgrzybiczych i immunomodulacyjnych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane protokoły inokulacji, pobierania próbek oraz ilościowego oznaczania obciążenia grzybiczego.
- Dostarcza powtarzalnych danych ilościowych, takich jak liczenie CFU oraz profilowanie komórek odpornościowych.
- Umożliwia pobieranie próbek podłużnych od tego samego zwierzęcia, co wspiera solidny rozwój testów i procesy przesiewowe.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z immunologią zakażeń u ludzi, co zwiększa znaczenie translacyjne w ocenie kandydatów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej poprzez umożliwienie analizy punktów końcowych w zakresie immunologicznym i histologicznym.
- Pozwala na dostosowanie postępu w opracowywaniu leków przeciwgrzybiczych i immunoterapeutycznych do poziomu ryzyka w oparciu o ilościowe odczyty zakażeń i odpowiedzi immunologicznej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten integruje się z kontinuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, umożliwiając testowanie hipotez, walidację celów oraz ilościową ocenę infekcji i odpowiedzi immunologicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badania nad interakcjami gospodarz-patogen oraz mechanizmami odpornościowymi oparte na hipotezach.
- Przesiewanie: Zapewnia zwalidowane, powtarzalne testy do oznaczania obciążenia grzybiczego i kwantyfikacji komórek odpornościowych.
- Analityka: Generuje dane ilościowe (liczba CFU, profile komórkowe) do analizy porównawczej w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość w ocenie punktów końcowych immunologicznych i infekcyjnych istotnych dla chorób ludzi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny różnorodnych hipotez zakaźnych i immunologicznych w dolnym odcinku żeńskich dróg rodnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach przeciwgrzybiczych i immunologicznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły zakażania i pobierania próbek w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową dzięki dostarczeniu rzetelnych danych przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów terapeutycznych skierowanych przeciwko zakażeniom błon śluzowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie obchodzenia się ze zwierzętami, modeli zakażeń oraz testów immunologicznych.
- Niezbędny jest dostęp do aparatury do pobierania próbek, mikroskopii oraz ilościowego wysiewu na płytki.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności badań.
- Metoda jest możliwa do adaptacji do innych modeli chorób zakaźnych dolnych dróg rodnych kobiet poprzez modyfikację protokołu.
- Kluczowe dla zachowania żywotności komórek i spójności danych są ostrożne obchodzenie się z próbkami oraz ich prawidłowe przetwarzanie.
