Ilościowe porównanie cisAktywności cis-elementów regulacyjnych (CRE) w organizmach transgenicznych Drosophila melanogaster

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe pomiar aktywności regulacyjnej genów elementów regulacyjnych CIS lub CRE aktywnych podczas rozwoju metamorficznego drosophila melan gastro. Należy rozpocząć od metod integracji specyficznej dla miejsca w celu wygenerowania linii CRE włączonych transgenicznie jako transgeny reporterowe. Używając stereomikroskopu, należy pobrać transgeniczne okazy na odpowiednim etapie rozwoju.

Wyjąć preparaty z zewnętrznej probówki i zamocować je na szkiełku przedmiotowym mikroskopu. Następnie zarejestrować poziom i wzór ekspresji fluorescencyjnego białka reporterowego w próbkach całych preparatów za pomocą analizy mikroskopowej konfokalnej. Na koniec określić ilościowo poziom ekspresji fluorescencyjnego białka reporterowego dla zarejestrowanych obrazów konfokalnych przy użyciu oprogramowania Image J.

Wyniki te przypisują poziom aktywności regulacyjnej genu, aby pomóc w identyfikacji elementów regulacyjnych i ułatwić dalsze porównawcze badania ekspresji genów w zmodyfikowanych wersjach CRE. Procedura ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące regulacji genów oraz sposobu kodowania tej regulacji. DNA odgrywa istotną rolę w biologii rozwoju i biologii ewolucyjnej.

Procedurę tę opracowano w celu uzyskania informacji na temat elementów cis-regulatorowych funkcjonujących podczas rozwoju metamorficznego Drosophila melanogaster. W zasadzie można ją jednak zastosować do elementów cis-regulatorowych działających podczas innych etapów rozwoju i u innych gatunków muszek owocówek, a nawet u innych organizmów modelowych. Aby zwiększyć liczbę linii transgenicznych, należy w dniach naprzemiennych przygotowywać dwie fiolki z kilkoma muchami samcami i samicami.

Przenieś muchy z jednej z probówek do nowej probówki. Powtarzaj tę czynność przez tydzień. Po dwóch tygodniach sprawdź, czy transgeniczne muszki owocowe znajdują się na różnych etapach rozwoju, od stadium larwalnego po postać dorosłą.

Rozpocznij etapowanie okazów pod koniec trzeciego stadium larwalnego, gdy utworzy się ER. Zauważ, że okaz jest nieruchomy. ER jest miękka i biała, a formy sferyczne są odwrócone, co określa ten moment czasowy.

W momencie 0 HAPF. Samców odróżniono od samic na podstawie obecności symetrycznie rozmieszczonych gonad w pobliżu środka ciała, które wyglądają jak półprzezroczyste kręgi, służące do określania stadium rozwoju na podstawie długości metamorfozy. W momencie 0 HAPF przenieść okazy do nowej fiolki za pomocą zwilżonego pędzla.

Dodaj kawałek chusteczki Kimwipe i zwilż go wodą, aby zapobiec wysychaniu okazów. Następnie inkubuj fiolkę w temperaturze 25 °C aż do osiągnięcia pożądanego HAPF. Alternatywnie, można przeprowadzić etapowanie okazów poprzez sortowanie na podstawie identyfikacji obecności i położenia kilku markerów morfologicznych, zgodnie ze szczegółami opisanymi w towarzyszącym tekście.

Za pomocą taśmy laboratoryjnej przyklej kawałek taśmy pakowej do deski sekcyjnej stroną klejącą do góry. Zwilż pędzel i nanieś wilgoć na preparaty. Przenieś preparaty na chusteczkę Kimwipe.

Przenieś okazy na taśmę pakową i przyklej je powierzchnią grzbietową skierowaną do góry. Pozostaw okazy do wyschnięcia na 15 minut. Stopniowo rozszerz ER za pomocą pęsety.

Zacznij od końca przedniego lub płetwy grzbietowej i przesuwaj się w stronę końca tylnego. Następnie przenieś pui do kropli lepkiego oleju na szkiełku przedmiotowym i oceń preparat mikroskopowo w przypadku preparatów całych. Użyj obiektywu 4x lub 10x, aby ustawić ostrość preparatu.

Korzystając z oprogramowania mikroskopu konfokalnego, dostosuj długość fali wzbudzenia dla wybranego białka fluorescencyjnego, aby zapobiec fotobleachingowi. Rozpocznij od natężenia lasera na poziomie 5-10%. Jeśli sygnał będzie zbyt słaby, zwiększ natężenie w razie potrzeby, aby poprawić stosunek sygnału do szumu. W przypadku obrazów konfokalnych włącz w ustawieniach oprogramowania funkcje uśredniające pomiary pikseli z powtarzanych skanów, takie jak uśrednianie Kalmana, w celu ilościowego porównania aktywności CRE w przekroju poprzecznym, gdzie fluorescencja jest najintensywniejsza.

Przełącz na tablicę wyszukiwania ostrzeżeń o nasyceniu i dostosuj wzmocnienie napięcia kanału oraz przesunięcie do ustawień, przy których nasyconych jest niewiele pikseli. W razie potrzeby dostosuj aperturę konfokalną. Po ustaleniu optymalnych ustawień przeprowadź skan ZS, aby uzyskać serię obrazów wzdłuż osi Z.

Po zakończeniu skanowania przekształć stos obrazów w projekcję i zapisz plik obrazu w formacie TIF. W celu ilościowego porównania aktywności CRE stosuj te same ustawienia konfokalne dla wszystkich powtórzeń próbek oraz linii z transgenem reporterowym. Aby rozpocząć eksperyment, uruchom program Image J i otwórz obraz TIFF przeznaczony do analizy.

Kliknij przycisk zaznaczania ręcznego i obrysuj obszar preparatu, w którym pożądana jest kwantyfikacja. Aby uzyskać statystykę wartości pikseli, kliknij zakładkę analizy, a następnie wybierz pomiar. Zapisz średni wynik wartości pikseli z okna wyników.

Należy również pobrać drugą średnią wartość pikseli z obszaru tła, w którym CRE nie jest aktywny. Aby uzyskać skorygowaną średnią wartość pikseli, należy kontynuować generowanie statystyk wartości pikseli dla powtórzeń próbek. Następnie, na podstawie skorygowanych średnich wartości pikseli z powtórzeń, należy wyznaczyć średnią aktywność regulacyjną dla A CRE oraz obliczyć błąd standardowy średniej.

W tym eksperymencie wykorzystuje się intensywność fenotypu oczu w wyniku ratowania genu white w celu uzyskania linii transgenicznych homozygotycznych. Do specyficznej integracji transgenu wykorzystuje się tło genetyczne mutanta genu white z sekwencją miejsca lądowania A TTP. Osobniki transgeniczne, hemizygotyczne i homozygotyczne pod kątem zintegrowanego wektora, rozróżnia się na podstawie intensywności uratowanego fenotypu koloru oczu, która zależy od liczby kopii zintegrowanego minigenu white.

Linie homozygotyczne są następnie ustanawiane poprzez krzyżowanie samców i samic much wykazujących najciemniejszy fenotyp koloru oczu. Markery morfologiczne są wykorzystywane do określenia stadium metamorficznego drosophila podczas przeobrażenia z larwy w dorosłą muszkę owocówkę. Okaz przechodzi przez szereg stereotypowych form morfologicznych, które można wykorzystać do określenia płci i przybliżenia stadium rozwojowego. Tutaj.

Wersja typu dzikiego elementu CRE, nazywana elementem dimorficznym, stymuluje wysoki poziom ekspresji reportera EGFP w segmencie brzusznym ASIC samic muchy. Stwierdzono, że sekwencja o długości 13 par zasad w obrębie tego CRE stanowi miejsce wiązania czynnika transkrypcyjnego DSX, a znaczenie tej sekwencji in vivo wykazano poprzez kwantyfikację aktywności regulacyjnej CRE w przypadku zmutowania tego miejsca wiązania. Analizy ilościowe wskazują, że mutacja tego miejsca DSX zredukowała aktywność regulacyjną do 28 ± 3% ekspresji typu dzikiego w kontekście zastosowanego tutaj miejsca insercji transgenu.

Podobne porównania służą do oceny aktywności regulacyjnej alleli CRE wewnątrzgatunkowych lub między autologicznymi CRE różnych gatunków, na przykład w odniesieniu do poziomów EGFP w segmencie żeńskim. Autologiczne CRE dla gatunków D. stimulants i D. willi, napędzane przez szczep D. Melin gastric Canin S, wykazują aktywności regulacyjne wynoszące odpowiednio 75 ± 4% oraz 0 ± 0%. Dalsze metody proceduralne, takie jak interferencja RNA, mogą być stosowane w odniesieniu do genów czynników transkrypcyjnych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące interakcji tych genów z elementami regulacyjnymi CYS.

Wskazywałoby to na wzrost i spadek ekspresji fluorescencyjnego białka reporterowego sterowanej przez elementy regulacyjne cis po ich opracowaniu. Procedura ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie regulacji genów do zgłębienia funkcjonalnego znaczenia motywów elementów regulacyjnych cis oraz ewolucyjnych mutacji dla ekspresji genów.