Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

W tym filmie aktywności kinazy i fosfatazy są monitorowane w trakcie cyklu komórkowego przy użyciu transferu energii między fluorescencyjnymi dipolami, znanego jako FRET. Tutaj sonda aktywności kinazy podobnej do Polo 1 (PLK1) posiada białko CFP (cyjanowa białka fluorescencyjna) umieszczone na jednym końcu oraz białko YFP (żółte białko fluorescencyjne) umieszczone na drugim końcu. Sonda ta jest transfektowana do komórek U2 OS.

Następnie, aby zbadać stan fosforylacji celów LK1 podczas przejścia z fazy G2 do fazy M, poddaje się przetransfekowane komórki U2 OS obrazowaniu fluorescencyjnemu w odstępach czasu (time-lapse). Gdy CFP i YFP znajdują się w bliskiej odległości i CFP zostanie pobudzony, energia jest przekazywana do YFP, co umożliwia detekcję emisji YFP. Jednak w momencie fosforylacji sondy następuje zmiana konformacyjna białka, która oddziela CFP od YFP.

Obecnie, gdy CFP zostanie wzbudzone, wykrywana jest silna emisja CFP i jedynie słaba emisja YFP; kwantyfikacja stosunku emisji YFP po wzbudzeniu zarówno CFP, jak i YFP wykazuje, że aktywność PLK1 wzrasta w fazie G2 i osiąga maksimum podczas mitozy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowe obrazowanie czasowe, jest fakt, że zwrócono szczególną uwagę na to, aby cykl komórkowy nie został zaburzony ani przez warunki obrazowania, ani przez ekspresję sondy. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie cyklu komórkowego, takie jak miejsce i czas aktywacji konkretnych kinaz lub fosfataz.

Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat enzymów regulowanych przez cykl komórkowy, można ją również zastosować w innych systemach wymagających warunków bezziełniowych, takich jak testy proliferacji komórek. W celu monitorowania ludzkiego cyklu komórkowego komórki U2 OS są transfekowane sondą aktywności PK1 opartą na technice FRET. Z zastosowaniem standardowej metody transfekcji fosforanem wapnia, komórki są selekcjonowane w puromycynie przez co najmniej siedem dni.

Pozwala to wzbogacić populację komórek wykazujących ekspresję sondy i ograniczyć liczbę komórek o toksycznych poziomach ekspresji lub poziomach, które silnie wpływają na cykl komórkowy. Następnie, poprzez ograniczające rozcieńczenia, wyselekcjonowano stabilne klony i zbadano ekspresję CFP oraz YFP, aby zweryfikować, czy są one obecne we wszystkich komórkach w zbliżonym stosunku. Jeśli niektóre komórki zawierają tylko CFP lub YFP, prawdopodobnie doszło do rekombinacji; w takim przypadku należy powtórzyć przygotowanie plazmidu z wykorzystaniem bakterii mniej podatnych na rekombinację homologiczną, takich jak szczepy Sure 2, a następnie zlinearyzować plazmid i powtórzyć transfekcję.

Gdy komórki zaczną stabilnie ekspresować sondę, wysiej je na szalki z dnem szklanym o grubości nr 1,5 po tym, jak przywrą i osiągną 30 do 50% konfluencji. Wymień medium na takie, które jest niezależne od CO2 i nie zawiera czerwieni fenolowej, a następnie umieść komórki na zmotoryzowanym mikroskopie epifluorescencyjnym z kontrolą temperatury ustawioną na 37 °C. Mikroskop powinien być wyposażony w filtry wzbudzenia i emisji dla CFP oraz YFP.

Lustro ROIC odpowiednie do monitorowania CFP i YFP oraz obiektyw zapewniający wymaganą rozdzielczość. W tym przypadku zastosowano obiektyw powietrzny 20 x NA 0,75. Używając światła przechodzącego, ustaw ostrość na komórkach.

Na tym etapie nie należy używać światła fluorescencyjnego, ponieważ wywoła ono reakcję stresową, która może zaburzyć cykl komórkowy. Aby uniknąć fototoksyczności, ustaw ugięcie na maksymalną dostępną wartość, która pozwala na uzyskanie wymaganej rozdzielczości subkomórkowej. W tym doświadczeniu powinno być możliwe rozróżnienie jądra komórkowego i cytoplazmy.

Ustaw krótki czas ekspozycji i wprowadź filtr neutralnej gęstości o wysokim współczynniku. Następnie wykonaj 12- lub 16-bitowy obraz testowy przy użyciu wzbudzenia i emisji YFP, dostosowując czas ekspozycji oraz filtry neutralnej gęstości tak, aby średnia intensywność w komórce była w przybliżeniu równa intensywności tła plus pięciokrotność różnicy między minimalną a maksymalną intensywnością tła. Aby zweryfikować, czy obrazy nie są nasycone, sprawdź intensywność fluorescencji dla obrazu próbki.

Maksymalna intensywność na obrazie powinna być mniejsza niż połowa zakresu dynamicznego, aby uwzględnić różnice w intensywności w momencie wejścia komórek w fazę mitozy. Następnie powtórz ten proces, stosując filtry wzbudzenia CFP i emisji YFP. Wybierz kilka obszarów z komórkami po transfekcji, z wyłączeniem obszarów wykorzystanych do ustawienia ostrości i optymalizacji warunków ekspozycji.

Ponieważ procedury te mogły wywołać odpowiedź stresową, należy upewnić się, że maksymalna intensywność we wszystkich komórkach stanowi mniej niż połowę zakresu dynamicznego. Skonfigurować oprogramowanie tak, aby co 45 minut rejestrowało dwa obrazy, wykorzystując wzbudzenie YFP, emisję YFP oraz wzbudzenie CFP i filtry emisji YFP.

Należy również ustawić całkowity czas trwania eksperymentu tak, aby przekraczał on czas trwania cyklu komórkowego. Po skonfigurowaniu wszystkich parametrów rozpocząć akwizycję obrazów; po zakończeniu akwizycji otworzyć uzyskane obrazy i monitorować czas cyklu komórkowego od jednej mitozy do drugiej. W przypadku komórek wykazujących ekspresję przetransfekcyjnej sondy czas cyklu komórkowego wynosił w przybliżeniu od 20 do 25 godzin.

Porównaj to z danymi kontrolnymi dla użytego typu komórek. Jeśli czas cyklu komórkowego odpowiada czasom referencyjnym, można przeprowadzić analizę FRET. Po zweryfikowaniu czasu można przystąpić do analizy obrazów.

Analizę można przeprowadzić za pomocą większości oprogramowania przeznaczonego do mikroskopii. W tym przypadku wykorzystano bezpłatny program ImageJ z wtyczką Ratio Plus. Analizę należy rozpocząć od otwarcia obrazów w programie ImageJ. Jeśli obrazy znajdują się w formacie wielokolorowego stosu (stack), należy rozdzielić poszczególne kanały, konwertując je na hiperstos (hyperstack) poprzez wybranie obrazu.

Następnie wybierz hyper stack, a potem stack to hyper stack. Otworzy się okno convert to hyper stack z wyświetlonymi ustawieniami; kliknij okay. Obraz zostanie teraz wyświetlony z dwoma suwakami poniżej.

Aby rozdzielić obrazy na stosy jednokanałowe, kliknij obraz i wybierz opcję „Hyperstack reduce dimensionality”. Otworzy się okno redukcji; upewnij się, że zaznaczone są opcje „Frames” oraz „Keep source”. Następnie kliknij Okay.

Pojawi się nowy obraz zawierający tylko jeden kanał. Powtórz ten proces, aby wyświetlić nowy obraz z drugim kanałem. Następnie, w celu zwiększenia klarowności wizualnej końcowych obrazów, wybierz stos YFP excitation YFP emission.

Kliknij proces, a następnie kliknij matematyka. Następnie wybierz mnożenie. Po otwarciu okna mnożenia wprowadź wartość trzy, aby pomnożyć stos YFP excitation YFP emission przez trzy. Krok ten jest opcjonalny i zapewnia, że współczynniki nie znajdują się w zakresie od zera do jednego.

Następnie na pasku narzędzi obrazu J wybierz narzędzie do rysowania swobodnego. Następnie w stosie wzbudzenia YFP i emisji YFP wyznacz obszar zainteresowania (ROI) w miejscu pozbawionym komórek, ale blisko komórki, która będzie mierzona; aby dodać ROI do menedżera ROI, kliknij narzędzia analizy (analyze tools), a następnie menedżera ROI (ROI manager).

Pojawi się okno menedżera ROI. Kliknij przycisk add, aby zapisać współrzędne ROI w celu pomiaru średniej intensywności ROI w stosie obrazów dla wzbudzenia YFP i emisji YFP. Kliknij analyze, a następnie wybierz measure.

Otworzy się okno wyników. Wybierz stos obrazów z wzbudzeniem CFP i emisją YFP. Następnie dwukrotnie kliknij interesujący obszar (ROI) w menedżerze ROI i powtórz pomiar.

Pomiar zostaje dodany do okna wyników. Przewiń do innych obszarów stosu, aby powtórzyć ten proces w wielu punktach czasowych. Zweryfikuj, czy intensywność tła w pobliżu analizowanej komórki jest podobna w całym filmie, porównując pomiary w oknie wyników.

Aby ustawić pomiary tak, aby uwzględniały minimalną intensywność, kliknij Analyze, następnie kliknij Set Measurements i określ minimalną oraz maksymalną wartość szarości. Następnie pojawi się okno z alternatywnymi opcjami pomiaru. Po dostosowaniu jasności i kontrastu w razie potrzeby, wyznacz ROI obejmujący większość komórki i zmierz minimalną intensywność w obu stosach obrazów.

Następnie przeprowadź pomiary w taki sam sposób jak wcześniej, tym razem używając komórki zamiast tła. Na podstawie wartości z sekcji wyników oblicz różnicę między zmierzoną intensywnością minimalną a intensywnością tła i podziel wynik przez dwa. Pozwoli to uzyskać wstępną szacunkową wartość przycinania dla stosunku otwarcia w wybranych wtyczkach.

Następnie wybierz ratio plus. W przypadku stosunku FRET wybierz stos CFP excitation YFP emission S stack one lub, dla odwróconego stosunku FRET przy wizualizacji sond, w których wydajność FRET spada podczas fosforylacji, wybierz stos YFP excitation YFP emission S stack one, aby wprowadzić zmierzone intensywności tła oraz wartości przycinania.

Użyj wartości z okna wyników i wklej je w okno ratio plus. Ustaw skalowanie otrzymanego stosu proporcji (ratio stack) i zastosuj odpowiednią tabelę wyszukiwania (lookup table), aby zwizualizować zmiany proporcji. Komórki U2 OS wykazujące ekspresję sondy opartej na FRET, monitorującej aktywność PLK1, były filmowane przez 60 godzin, zgodnie z opisem w tym filmie.

Na tym obrazie przedstawiono skumulowane wejście w fazę mitozy 50 komórek wykazujących ekspresję sondy FRET, wliczając w to podziały komórek potomnych. Większość komórek wykazujących ekspresję sondy proliferuje przy czasie cyklu komórkowego wynoszącym od 20 do 25 godzin, co wskazuje, że warunki obrazowania i poziomy ekspresji sondy nie wpływają na czas trwania cyklu komórkowego. Reprezentacja w fałszywych barwach odwróconego stosunku FRET, śledząca jedną komórkę przez cztery podziały, wykazuje, że mimo znacznego szumu, widoczny jest trend, w którym aktywność PK1 wzrasta w fazie G2 i osiąga szczyt podczas mitozy.

Po zastosowaniu filtru średniej do surowych danych i przedstawieniu ich na wykresie, czas między szczytami aktywności jest łatwy do oszacowania. Ten rysunek przedstawia kwantyfikację odwróconego stosunku FRET dla komórki pokazanej na poprzednich obrazach na podstawie wykresu. Można oszacować czas aktywacji i, jak widać tutaj, fosforylacja sondy staje się widoczna mniej więcej na cztery godziny przed osiągnięciem szczytu fosforylacji w mitozie.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest utrzymanie komórek w stanie braku stresu, co osiąga się poprzez minimalizację ekspozycji na światło oraz ograniczenie zmian temperatury lub pH. Należy również pamiętać, że metoda ta monitoruje równowagę między aktywnością kinaz a fosfataz w komórce. Procedurę tę można połączyć z interferencją RNA lub badaniami inhibitorów w celu zidentyfikowania regulatorów nadrzędnych tych kinaz i fosfataz.