Chirurgiczne usuwanie powierzchownych węzłów chłonnych u myszy
21 maja 2012
Aby śledzić przebieg odpowiedzi immunologicznej w czasie u tej samej myszy, węzły chłonne można usuwać sekwencyjnie drogą chirurgiczną. W niniejszym materiale opisujemy sposób wykonania tej techniki.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest chirurgiczne usunięcie węzłów chłonnych u znieczulonej myszy. Realizuje się to poprzez najpierw zlokalizowanie węzłów chłonnych. Następnie pobiera się węzły chłonne, a po ich usunięciu zamyka się nacięcie.
Na koniec, do analizy eksperymentalnej można uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. W ostateczności żywe populacje limfocytów można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej. Wizualna demonstracja tej techniki jest kluczowa, ponieważ lokalizacja i usuwanie węzłów chłonnych muszą zostać zaprezentowane, aby można było opanować tę procedurę.
Po znieczuleniu myszy należy nałożyć maść do oczu, podać buprenorfinę i potwierdzić sedację za pomocą ucisku palca u nogi, a następnie ułożyć mysz na boku. Najpierw należy zlokalizować węzeł chłonny pachwinowy, a następnie ogolić obszar przeznaczony do sekcji. Po usunięciu luźnych włosów pędzlem, należy zastosować środek dezynfekujący w tym obszarze, a następnie wykonać niewielkie nacięcie o długości około five millimeters na grzbiecie przedniej kończyny.
Za pomocą dwóch par pęset rozszerz nacięcie, aż do momentu, gdy będzie widoczny węzeł chłonny pachowy, który może mieć szary kolor lub być ciemniejszy od otaczającej go tkanki tłuszczowej. Następnie jedną pęsetą uchwyć powięź pokrywającą węzeł chłonny. Drugą pęsetę umieść jak najgłębiej pod węzłem chłonnym i lekko pociągnij błonę, uważając, aby nie przerwać otaczającej tkanki.
Następnie za pomocą pierwszej pary pęsety przerwij powięź i wyjmij węzeł chłonny. Jeśli węzeł chłonny został pomyślnie pobrany, w miejscu jego wcześniejszego położenia pojawi się ślad krwi. Umieść wycięty węzeł chłonny w roztworze izotonicznym; jeśli tkanka opadnie na dno, potwierdzi to, że pobrany materiał jest węzłem chłonnym, a nie tkanką tłuszczową.
Następnie należy upewnić się, że w ranie nie znajdują się żadne włosy, a następnie zamknąć nacięcie, dociskając do siebie wewnętrzne brzegi skóry i staplując je za pomocą jednego lub dwóch zszywek, w zależności od wielkości nacięcia. Teraz należy zlokalizować węzeł chłonny pachwinowy i ogolić obszar przeznaczony do wycięcia. Po usunięciu szczotką luźnych włosów należy zastosować środek dezynfekujący w tym regionie, a następnie wykonać niewielkie nacięcie o długości około 5 mm powyżej tylnej łapy, w pobliżu brzucha.
Po rozszerzeniu nacięcia za pomocą dwóch par pęset, tak jak pokazano przed chwilą w przypadku węzła chłonnego ramiennego, zidentyfikuj węzeł chłonny pachwinowy znajdujący się w otaczającej go tkance tłuszczowej. Następnie usuń węzeł chłonny za pomocą dwóch par pęset, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Ponownie potwierdź pomyślne pobranie węzła chłonnego, zwracając uwagę na ślad krwi pojawiający się w miejscu, w którym wcześniej znajdował się węzeł, a następnie przełóż węzeł chłonny pachwinowy do osobnego pojemnika z roztworem izotonicznym.
Po pobraniu wszystkich węzłów chłonnych umieść mysz w klatce i podaj mokrą karmę, aby zwierzę mogło łatwo się odżywić. Około sześciu do ośmiu godzin po zabiegu sprawdź stan myszy, aby upewnić się, że nie odczuwa ona bólu. Uważnie obserwuj, czy postawa, chód, interakcje z towarzyszami z klatki oraz wygląd futra są zbliżone do tych u zdrowej myszy.
Na koniec rozdziel węzeł chłonny, dociskając go do szkiełek matowych w szalce Petriego, a następnie przenieś go do probówki, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Po zabarwieniu komórek pod kątem interesujących antygenów powierzchniowych, poddaj je analizie za pomocą cytometrii przepływowej. Poniżej przedstawiono przykładowe wykresy rozproszenia forward scatter oraz side scatter dla węzłów chłonnych pobranych od zwierząt zanieczulonych lub uśmierconych.
Profile oraz odsetki komórek w bramkach dla żywych limfocytów na obu wykresach rozrzutu są takie same. Dowodzi to, że operacja usunięcia węzła chłonnego jest odpowiednią techniką pozyskiwania komórek. Po opanowaniu metody, operacja usunięcia węzła chłonnego może zostać przeprowadzona w czasie od 5 do 10 minut na mysz, pod warunkiem właściwego wykonania.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje technikę chirurgiczną sekwencyjnego usuwania węzłów chłonnych u znieczulonej myszy w celu monitorowania odpowiedzi immunologicznej w czasie. Procedura obejmuje lokalizację węzłów chłonnych, ich pobranie oraz zamknięcie nacięcia, a następnie przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek do analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Techniki chirurgiczne
- Analiza eksperymentalna
Wstęp
- Zrozumienie odpowiedzi immunologicznych ma kluczowe znaczenie w badaniach.
- Węzły chłonne odgrywają kluczową rolę w układzie odpornościowym.
- Sekwencyjne usuwanie pozwala na analizę czasową odpowiedzi immunologicznych.
- Techniki wizualne wspomagają naukę i opanowanie procedury.
Cel badania
- Przedstawienie chirurgicznego usuwania węzłów chłonnych u myszy.
- Ułatwienie badania przebiegu odpowiedzi immunologicznej.
- Zapewnienie wizualnego przewodnika dla badaczy.
Zastosowane metody
- Lokalizacja węzłów chłonnych u znieczurzonej myszy.
- Chirurgiczne usunięcie węzłów chłonnych.
- Zamknięcie nacięcia po zabiegu.
- Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek do analizy.
Główne wyniki
- Pomyślnie usunięto węzły chłonne.
- Uzyskano żywe populacje limfocytów.
- Do oceny limfocytów wykorzystano cytometrię przepływową.
- Demonstracje wizualne poprawiły zrozumienie techniki.
Wnioski
- Technika ta pozwala na skuteczne monitorowanie odpowiedzi immunologicznych.
- Pomoce wizualne są niezbędne do opanowania procedur chirurgicznych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu uzyskania głębszych informacji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Sekwencyjne operacje węzłów chłonnych umożliwiają podłużne śledzenie odpowiedzi immunologicznych u tego samego zwierzęcia, co redukuje zmienność eksperymentalną i wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie walidacji celu. Podejście to dostarcza wystarczającej liczby żywych limfocytów do analiz fenotypowych i funkcjonalnych, zwiększając wiarygodność predykcyjną w przedklinicznych badaniach immunologicznych. Dzięki umożliwieniu przeprowadzenia eksperymentów w przebiegu czasowym, technika ta wspiera ciągłość translacyjną od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju bi farmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez analizę czasową ekspansji limfocytów w węzłach chłonnych.
- Wartość operacyjna: Ogranicza liczbę wykorzystywanych zwierząt oraz zmienność eksperymentalną dzięki wielokrotnemu pobieraniu próbek od tej samej myszy.
- Wartość naukowa: Wspiera redukcję ryzyka biologicznego poprzez charakteryzację fenotypów limfocytów rezydujących w węzłach chłonnych w czasie.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Uzyskuje się 1-2x10⁶ komórek z każdego węzła chłonnego, co jest wystarczające do charakterystyki fenotypowej i testów funkcjonalnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne zawiesiny komórkowe do późniejszej analizy cytometrycznej.
- Wartość naukowa: Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do wiarygodnej oceny związków w badaniach przesiewowych z zakresu immunologii.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie systemów istotnych dla przebiegu chorób poprzez śledzenie dynamiki komórek odpornościowych w węzłach chłonnych w czasie.
- Wartość operacyjna: Ułatwia dostosowanie biomarkerów translacyjnych dzięki podłużnemu monitorowaniu układu odpornościowego.
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych, umożliwiając mechanistyczną redukcję ryzyka w szlakach immunologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć, od testowania hipotez po walidację przedkliniczną, wspierając monitorowanie odpowiedzi immunologicznej oraz analizę funkcjonalną limfocytów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez profilowanie czasowe odpowiedzi immunologicznej.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki uzyskiwaniu powtarzalnych zawiesin pojedynczych komórek z pobranych węzłów chłonnych.
- Analityka: Pozwala na generowanie ilościowych populacji limfocytów do porównań w różnych punktach czasowych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez ciągłe monitorowanie układu odpornościowego w systemach istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi reużywalną procedurę chirurgiczną do podłużnych badań immunologicznych w ramach wielu projektów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu dzięki podłużnemu monitorowaniu odpowiedzi immunologicznej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność pozyskiwania oraz przetwarzania limfocytów.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w programach immunologicznych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko w oparciu o czasowe dane dotyczące odpowiedzi immunologicznej z sekwencyjnego pobierania próbek.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w zakresie technik chirurgicznych u myszy oraz protokołów znieczulania.
- Konieczne jest zastosowanie sterylnych instrumentów oraz roztworów izotonicznych w celu konserwacji tkanek.
- Wymagana jest standaryzacja między zespołami w celu zapewnienia spójności w lokalizacji i pobieraniu węzłów chłonnych.
- Należy uwzględnić kwestie adaptacyjne dla różnych lokalizacji węzłów chłonnych (ramiennych, pachwinowych) oraz różnych szczepów myszy.
- Metoda jest ograniczona odstępami czasu na rekonwalescencję pooperacyjną, co pozwala na pobieranie próbek z danego węzła co drugi dzień.
