Sterowana polem elektrycznym migracja kierunkowa komórek progenitorowych neuronów w środowiskach 2D i 3D

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zarejestrowanie wpływu przyłożonych pól elektrycznych na migrację komórek progenitorowych neuronów w kulturach 2D oraz modelach 3D ex vivo. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację i ekspansję komórek progenitorowych neuronów in vitro. Drugim krokiem jest przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek progenitorowych neuronów.

Następnie, w celu przygotowania hodowli 2D, komórki progenitorowe neuronów wysiewa się do specjalnie zaprojektowanych komór elektrotaktycznych. Alternatywnie, do przygotowania modelu 3D ex vivo, komórki progenitorowe neuronów znakuje się białkiem Hook3 i wstrzykuje do organotypowego modelu skrawka rdzenia kręgowego. Ostatecznie, do komór elektrotaktycznych przykłada się pole elektryczne i wykonuje rejestrację time-lapse, aby wykazać, że komórki progenitorowe migrują w stronę katody pola elektrycznego zarówno w środowisku 2D, jak i 3D.

Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona nowatorską metodę śledzenia na żywo migracji poszczególnych komórek indukowanej polem elektrycznym po przeszczepieniu ich do 3D modelu organotypowego, który ściśle przypomina środowisko naturalne. Metoda ta może nie tylko dostarczyć wglądu w technikę elektrokinetyczną oraz migrację komórek neuroepithelialnych przeszczepionych do skrawka rdzenia kręgowego, ale może być również zastosowana w innych systemach, takich jak modele małych skrawków mózgu. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj szklane paski o wymiarach 22 na 11 mm, dzieląc autoklawowane szkło o wymiarach 22 na 22 mm.

Przeciąć szkiełka podstawkowe o grubości nr 1 na pół za pomocą rylca diamentowego. Następnie stworzyć wolnostojącą studzienkę szklaną o wymiarach wewnętrznych 22 na 10 mm, sklejając cztery pionowo ustawione paski o wymiarach 22 na 11 mm za pomocą wysokopróżniowego smaru silikonowego; pozostawić studzienkę do całkowitego wyschnięcia i utwardzenia przez noc. Następnego dnia przytwierdzić dwa szklane paski o wymiarach 22 na 11 mm równolegle do siebie, zachowując odstęp 10 mm, do dna naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm, używając smaru silikonowego.

Następnie uszczelnij obszar pomiędzy tymi paskami, przytwierdzając szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 by 22 milimetrów za pomocą smaru silikonowego. Umieść wgłębnik szklany na szkiełkach nakrywkowych w taki sposób, aby ścianki wewnętrzne stworzyły ograniczoną przestrzeń do wysiewania komórek. Wszystkie połączenia uszczelnij smarem silikonowym.

Pokryj ten ograniczony obszar sekwencyjnie polilizyną, a następnie lamininą, zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie. W tej procedurze pobierz mózgi od myszy w dniach E 14 do E 16 i umieść je w zimnej pożywce podstawowej D-M-E-M-F 12. Następnie usuń oponami mózgowymi pod mikroskopem anatomicznym.

Następnie przenieś mózgi do 35 milimetrowejy szalki Petriego. Za pomocą precyzyjnej pęsety rozdziel mózgi na fragmenty tkanki. Następnie przenieś je do 15 mililitrowej probówki do wirowania.

Próbki wirowano z prędkością 800 RPM przez trzy minuty w celu usunięcia zanieczyszczeń D. Następnie do próbek dodano A-D-M-E-M-F 12 zawierający BFDF oraz DGF. Próbki wymieszano za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra.

Następnie uzyskaj zawiesinę pojedynczych komórek za pomocą sitka do komórek. Wysiej komórki do kolb w zagęszczeniu od 20 000 do 50 000 komórek na mililitr. Następnie co trzy dni wymieniaj całkowicie pożywkę, co obejmuje wirowanie komórek przy 1 300 RPM przez pięć minut.

Odlej nadlewkę, zawieś PT w świeżej pożywce i przełóż komórki z powrotem do kolby co sześć dni, po upływie co najmniej pięciu. Przenieś NEUROSPHERES do probówki o pojemności 15 ml i wiruj przy 1 500 RPM przez pięć minut. Odlej nadlewkę.

Resuspenduj osad w TRIS-EDTA, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Przed wykonaniem zliczenia komórek przygotuj jeden mililitr zawiesiny zawierającej 10 000 komórek. Następnie usuń lamininę z dołka szklanego i pozwól jej całkowicie wyschnąć.

Zastąp ją jednym mililitrem zawiesiny komórkowej. Następnie umieść szalkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na minimum cztery godziny, aby umożliwić adhezję. Po osiągnięciu przez komórki odpowiedniej konfluencji, usuń pożywkę z komory.

Ostrożnie usuń szkło. Następnie utwórz „dach” nad komórkami, mocując ostrożnie za pomocą smaru silikonowego szkiełko nakrywowe do autoklawu o wymiarach 22 by 22 milimetrów pomiędzy dwiema listwami o wymiarach 22 by 11 milimetrów. Pamiętaj, aby pokryć komórki kilkoma kroplami pożywki, aby zapobiec ich wysychaniu.

Następnie utworzyć odizolowane zbiorniki z pożywką na każdym końcu komory, tworząc dwie wodoszczelne bariery z smaru silikonowego, rozciągające się od jednego końca naczynia do drugiego. Wypełnić komorę świeżą pożywką, zapewniając przepływ z jednego zbiornika do drugiego. Następnie umieścić naczynie z powrotem w inkubatorze na 12 godzin w celu regeneracji komórek.

W następnym kroku przygotuj pokrywkę do naczynia, wiercąc w niej dwa otwory, z których każdy znajduje się nad jednym z rezerwuarów komory migracyjnej. Następnie wymień medium w komorze na medium hodowlane zawierające 25 milimolowy bufor HIPPS. Po tym czasie przenieś naczynie do systemu obrazowania z kontrolą temperatury.

Ustaw parametry eksperymentalne dla rejestracji w odstępach czasu (time lapse) oraz wielopozycyjnej. Wyrównaj komorę tak, aby katoda i anoda znajdowały się odpowiednio po lewej i prawej stronie, co zapewni poziomy przebieg wektora pola elektrycznego w obrazie mikroskopowym i systemie obrazowania. Następnie napełnij dwa zlewki.

Przy użyciu roztworu Steinberga. Połącz oddzielny zlew z każdym zbiornikiem z pożywką, wykorzystując wcześniej przygotowane mostki szklane wypełnione 2% roztworem agaru Steinberga. Następnie umieść srebrne elektrody podłączone do zasilacza prądu stałego w roztworze Steinberga.

W każdym zlewce ustaw pokrętło napięcia zasilacza na zero i włącz urządzenie. Mierząc napięcie w komorze elektrotaktycznej za pomocą woltomierza, stopniowo zwiększaj wartość na pokrętle napięcia. Następnie dostosuj napięcie zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.

Następnie rozpocznij nagrywanie poklatkowe. Wymień medium i w razie potrzeby ponownie dostosuj napięcie. Co godzinę do zbiorników można dodawać świeże medium, leki lub odczynniki chemiczne, zgodnie z potrzebami.

Wykorzystując dodatkowe otwory wywiercone w pokrywie szalki hodowlanej, z których każdy znajduje się nad zbiornikiem z pożywką. Na tym etapie należy wypreparować rdzenie kręgowe odcinka lędźwiowego u dwutygodniowych myszy. Następnie, używając krojarki do tkanek Machel-Wane pod mikroskopem anatomicznym, należy pociąć rdzenie kręgowe na przekroje o grubości 500 micron.

Rozdziel plastry i wybierz te, w których struktura rdzenia kręgowego w przekroju strzałkowym i osiowym jest nienaruszona. Następnie umieść plastry w 100 milimetrowej szalce Petriego zawierającej 30 µL żelu MA. Umieść je jak najbliżej środka.

Przechowuj je w inkubatorze z 5% carbon dioxide w temperaturze 37 degrees Celsius przez co najmniej 30 minut. Aby białka matrigelu mogły samoorganizować się i utworzyć cienką warstwę pokrywającą powierzchnię skrawków rdzenia kręgowego, bardzo ważne jest, aby matrigel został całkowicie zmontowany. W razie potrzeby inkubuj szalkę Petriego w temperaturze 37 degrees Celsius przez kolejne 30 minut, a następnie dodaj od czterech do sześciu mililitrów pożywki D-M-E-M-F 12 zawierającej 25 millimolar heis buffer oraz 15 do 20% fetal calf serum.

Bardzo delikatnie, aby uniknąć bezpośredniego przepływu medium na plastry, upewnij się, że plastry nie są całkowicie zanurzone w medium, pozostawiając powierzchnię bakłażanów dobrze wystawioną na powietrze. Wymieniaj medium dwa razy w tygodniu. Teraz inkubuj zawiesinę komórek progenitorowych neuronów w medium z pięciomikromolarnymi hakami.

3, 3, 3, 4, 2 przez 30 minut. Pod mikroskopem, za pomocą szklanej kapilary, wstrzyknij mikroobjętościowo 2 µL zawiesiny do skrawka rdzenia kręgowego. Powoli upewnij się, że szklana kapilara przechodzi przez matrigel i dociera do wnętrza skrawka rdzenia kręgowego.

Pozostaw szklaną rurkę wewnątrz skrawka rdzenia kręgowego przez co najmniej 30 sekund, aby uniknąć zawieszenia komórek. Następnie umieść szalkę Petriego zawierającą skrawek rdzenia kręgowego w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 na noc. Następnego dnia zbuduj wokół skrawka rdzenia kręgowego komorę elektrotaktyczną zawierającą haczyki 3 3 3 4 2 z oznakowanymi komórkami neurogenezy, a następnie przyłóż pole elektryczne o natężeniu 500 mV/mm.

Tutaj komórki progenitorowe neuronów wykazują silnie ukierunkowaną migrację w stronę katody pod wpływem pól elektrycznych; czerwone linie i niebieskie strzałki reprezentują odpowiednio trajektorie i kierunek ruchu komórek. A tutaj znajduje się wykres przedstawiający ścieżki migracji. Tutaj przedstawiono komórki progenitorowe neuronów znakowane hooks 3 3, 3, 4 2.

Zostały one przeszczepione do organotypowego skrawka rdzenia kręgowego w momencie rozpoczęcia zabiegu polem elektrycznym. Po tym, jak progenitorowe komórki neuronalne migrowały kierunkowo w stronę katody przez 2,5 godziny, polaryzację pola elektrycznego odwrócono. Zmiana polaryzacji pola elektrycznego wywołała gwałtowny zwrot aksonów w kierunku nowej katody.

Oto obraz przeszczepionych komórek progenitorowych neuronów w przekroju rdzenia kręgowego. Na końcu nagrania poklatkowego przedstawiona jest rekonstrukcja 3D przeszczepionych komórek progenitorowych neuronów w przekroju rdzenia kręgowego. Masowo opanowane.

Technika ta, po odpowiednim wdrożeniu, może zostać przeprowadzona w ciągu dwóch tygodni. Obecnie otwiera ona przed badaczami w dziedzinie biologii komórki możliwość badania migracji komórek progenitorowych neuronów w systemach hodowli 2D i 3D w odpowiedzi na przyłożone pole elektryczne.