Wykrywanie mikroregionalnej hipoksji w korze mózgowej myszy za pomocą obrazowania dwufotonowego endogennej fluorescencji NADH

Ogólnym celem tej procedury jest bezpośrednia wizualizacja mikroregionalnej hipoksji tkankowej w korze mózgu myszy in vivo. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie otwartego okna czaszkowego u znieczulonej myszy. Następnie dożylnie wstrzykuje się barwnik fluorescencyjny w celu oznakowania naczyń krwionośnych mózgu.

Na koniec przeprowadzono jednoczesne obrazowanie fotonowe wewnętrznej fluorescencji NADH oraz fluorescencyjnie znakowanej mikrokrążenia kory mózgowej. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące funkcjonalną hipoksję w mikroregionach miąższu mózgu poprzez wizualizację obecności zredukowanej formy nikotynamidoadeninodynukleotydu. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak elektrody typu Clarka, jest wysoka rozdzielczość przestrzenna w szerokim polu widzenia oraz mniejsza inwazyjność.

Tę metodę można przeprowadzić na standardowym systemie dwufotonowym z dwoma kanałami fluorescencyjnymi. Dzień dobry, jestem Steve Hurst, profesor i kierownik katedry mikrobiologii i immunologii na Uniwersytecie w Rochester. Procedurę zaprezentują dziś Anita's son z laboratorium dr. Kishki oraz Oxana Paulka, profesor asystent w moim laboratorium. Dr Kishka, pionier techniki obrazowania NADH, nie może być dzisiaj obecny ze względu na niedawną przeprowadzkę do Niemiec. Po przygotowaniu pola operacyjnego za pomocą niezbędnych narzędzi, które zostały poddane autoklawowaniu lub zdezynfekowane 70% ethanol, oraz po znieczuleniu myszy 5% isof fluorine, należy umieścić zwierzę na podkładce grzewczej i założyć maskę twarzową w celu podawania 1,3 do 1,5% isof fluorine w powietrzu.

Sprawdź poziom znieczulenia, wykonując ucisk ogona. Następnie wprowadź sondę rektalną i przez cały czas trwania procedury na bieżąco mierz temperaturę ciała zwierzęcia. Nałóż żel do sztucznych łez na oczy myszy, aby zapobiec ich wysychaniu.

Następnie należy usunąć sierść z głowy oraz obu ud, nakładając środek do depilacji na udo przez dwie minuty w celu usunięcia pozostałej sierści; udo to zostanie wykorzystane do oksymetrii. Na koniec należy zdezynfekować skórę czaszki, używając 10% roztworu powidon-jodu oraz 70% etanolu. Aby wykonać okno czaszkowe, należy naciąć czaszkę nożyczkami w odległości pięciu milimetrów od krawędzi.

Wykonaj nacięcie skóry głowy i posuń się o jeden centymetr. Odsuń skórę na boki, aby odsłonić czaszkę i usunąć znajdujące się na niej błony. Zastosuj 10% roztwór chlorku żelaza.

Zetrzyj nadmiar roztworu i zeskrob błony pod kątem 45 stopni. Numer pięć, pęseta. Używając mikroskopu sekcyjnego, zidentyfikuj obszar zainteresowania. Nałóż cienką warstwę kleju szybkoschnącego wokół krawędzi otworu w płytce głowowej.

Ustaw płytkę głowową w taki sposób, aby obszar zainteresowania był widoczny w okienku, a następnie lekko dociśnij płytkę. Nałóż niewielką ilość cementu stomatologicznego, aby szybko spolimeryzować klej. Przytrzymaj przez 10 sekund podczas polimeryzacji kleju.

Nanieś niewielką ilość kleju szybkoschnącego na krawędzie okna, aby uszczelnić płytkę głowową i czaszkę. Następnie przykręć płytkę głowową do uchwytu zwierzęcia pod mikroskopem dissectingowym. Użyj zestawu dwóch wiertarek mikro-momentowych ustawionych na 6, 000 RPM oraz wiertła IRF 0 0 5.

Usuń cały nadmiar kleju z czaszki oraz z płytki stabilizującej głowę. Następnie ustaw wiertarkę na 1000 RPM i rozpocznij wiercenie w czaszce, wykonując wewnątrz otworu płytki stabilizującej głowę okrąg o średnicy około 5 mm. Stosuj lekkie, zamiatające ruchy, tak jakbyś rysował bardzo miękkim ołówkiem.

Należy przerywać wiercenie co 20 do 30 sekund i używać sprężonego powietrza do usuwania pyłu kostnego. W miarę postępu wiercenia, wokół nienaruszonej czaszki w centrum tworzy się kanał. Należy uważać, aby nie przebić cienkiej czaszki, dbając jednocześnie o to, aby kanał ten miał równomierną grubość.

Dodatkowo należy zachować szczególną ostrożność w pobliżu dużych naczyń krwionośnych. Nie wolno ich uszkodzić, a jeśli to możliwe, nawet nie należy ich dotykać. Za pomocą jednego ramienia pęsety unieś kość w centrum okna i nanieś kroplę sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego na okno. Używając rogu chusteczki Kim wipe, delikatnie usuń sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy, przecierając pod kątem 45 stopni.

Numer pięć, pęseta. Zlokalizuj obszar uszkodzonej opony twardej wzdłuż krawędzi okna i unieś go, aby go usunąć. W przypadku wystąpienia krwawienia nanieś kroplę sztucznego CSF i odczekaj od dwóch do trzech minut, aż niewielkie krwawienie ustąpi.

Następnie przygotuj 10 ml 0,07% niskotopliwego aero rozpuszczonego w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym. Doprowadź roztopione aero do temperatury ciała. Usuń nadmiar sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego z powierzchni mózgu.

Wlej aero w okienko i przykryj je szkiełkiem podstawowym. Następnie delikatnie dociśnij szkiełko, aby zapewnić kontakt między nim a płytką głowową, i odczekaj od 10 do 20 sekund, aż aero stężeje. Za pomocą pęsety i miękkiej chusteczki higienicznej usuń nadmiar aero ze szkiełka osłonowego.

Nałóż niewielką ilość kleju szybkozastygającego wokół szkła, aby przykleić je do płytki głowowej. Następnie nałóż niewielką ilość cementu dentystycznego, aby utrwalić klej przed wstrzyknięciem do żyły udowej. Obróć zwierzę częściowo, aby odsłonić wewnętrzną stronę lewego uda.

Użyj taśmy, aby unieruchomić zwierzę. W tej pozycji zastosuj szorowanie antyseptyczne, a następnie nałóż 100% etanol na skórę. Następnie wykonaj nacięcie wzdłuż przyśrodkowej strony uda, od kolana do syntezy łonowej.

W razie potrzeby oddziel tkanki miękkie za pomocą rozczepiania tępego. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml 130 µL Texas red. Przymocuj nową igłę o rozmiarze 30 G i ostrożnie zagnij ją pod kątem 30°, kierując ścięcie igły do góry.

Napełnij igłę roztworem Texas Red pod mikroskopem stereoskopowym, wprowadź igłę do żyły udowej i wstrzyknij 100 µL Texas Red. Wyjmij igłę i lekko uciśnij żyłę gazikiem, aby zatamować krwawienie. Zamknij skórę za pomocą szwu 4-0 w celu ciągłego monitorowania wysycenia krwi tlenem.

Umieść sondę oksymetru na prawym udzie, z którego wcześniej usunięto owłosienie. Aby rozpocząć obrazowanie, przenieś chirurgicznie przygotowaną mysz na stolik mikroskopu. Wykonaj początkowe zdjęcie miejsca okna czaszkowego, korzystając z oświetlenia w polu jasnym przy powiększeniu czterokrotnym, aby służyło ono jako mapa referencyjna do rejestracji z większym powiększeniem w celu obrazowania fotonów.

Przybliż obszar zainteresowania, używając 10-krotnego powiększenia. Wybierz obszar zainteresowania w warstwach kory. Naciśnij jeden lub dwa przyciski, aby rozpocząć rejestrację serii czasowej.

Zalecamy użycie średnio od trzech do pięciu klatek w celu zwiększenia jakości obrazu. Następnie wywołaj hipoksemię, dodając 50% nitrogen do powietrza, którym oddycha zwierzę. Spowoduje to obniżenie poziomu tlenu do 10%. Zweryfikuj wystąpienie hipoksemii, monitorując dane z oksymetru.

Kontynuuj rejestrację serii czasowej podczas hipoksemii przez około 30 sekund oraz po przywróceniu prawidłowego poziomu tlenu. Zbierz dane do obliczenia rozkładu tlenu poprzez wykrywanie, pomiar i ilościowe określenie obszaru niedotlenienia oraz cylindrów tkanek utlenowanych wokół naczyń krwionośnych. Aby wyznaczyć promień cylindra tkankowego R, zmierz odległość między środkiem naczynia krwionośnego a granicą, przy której wykrywana jest wysoka fluorescencja NADH.

Metody przetwarzania danych opisano w protokole pisemnym. Rysunek przedstawia jednoczesne obrazy NADH i geograficzne z filmu zarejestrowanego podczas przejściowej hipoksemii; stężenie tlenu w powietrzu wdechowym obniżono z 21% do 10% na okres trzech minut. Ten poziom eksperymentalnie wywołanej hipoksemii jest wystarczający do wywołania ciężkiej hipoksji w korze mózgowej.

Hipoksja doprowadziła do wzrostu fluorescencji NADH, zaznaczonej na zielono, początkowo w obszarach najdalej oddalonych od dopływu krwi tętniczej. Należy zwrócić uwagę na ostre granice NADH w tkance, które reprezentują obserwowalne granice dyfuzji tlenu z mikrokrążenia korowego, zaznaczone na czerwono. Poniżej znajduje się obraz współbieżny mikro naczyń korowych znakowanych fluorescencyjnie na czerwono oraz wewnętrznej fluorescencji NADH z istoty szarej kory na zielono; rozkład intensywności fluorescencji NADH ma charakter binarny.

Występują obszary z jednolicie niską fluorescencją NADH oraz obszary z jednolicie wysoką fluorescencją NADH. Żółte linie reprezentują granice tkankowe pomiędzy obszarami o niskiej i wysokiej fluorescencji NADH. Granice tkankowe te wykazują zależność przestrzenną względem pobliskich mikronaczyń.

Zależność ta jest określana przez dyfuzję tlenu z mikronaczyń do tkanki. W niektórych przypadkach cylindryczny charakter lub cylindryczna tkanka CRO tych granic tkankowych może być bezpośrednio rozpoznana, co wskazują niebieskie linie. W tym przypadku granica tkankowa ma kształt koła z koncentrycznym centralnym naczyniem krwionośnym po opanowaniu metody.

Technikę tę można przeprowadzić w 1,5 godziny, jeśli jest ona wykonana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o przyklejeniu szkiełka przykrywnego do metalowej płytki, aby zapobiec pionowemu przemieszczeniu się powierzchni kory wskutek obrzęku. Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić dodatkowe analizy, takie jak pomiary hiperemii funkcjonalnej, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące związku między hipoksją tkankową a sprzężeniem naczyniowo-nerwowym.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat wizualizacji mikroregionalnej hipoksji tkankowej w korze mózgu myszy.