Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Celem niniejszego układu eksperymentalnego jest charakterystyka udziału konkretnych białek w procesie inwazji. Należy rozpocząć od transdukcji retrowirusowej komórek z zastosowaniem interesującego nas białka fluorescencyjnego. Należy również utworzyć trójwymiarową macierz białka matrigel w insertach transwell oraz przygotować zawiesinę komórkową o odpowiednim rozcieńczeniu.

Wykorzystując system transwell z Matrigelem, należy zmierzyć odpowiedź transmigracyjną na chemoatraktant w obecności badanych leków lub preparatów, a następnie przejść do wizualizacji i analizy inwazji komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ostatecznie wyniki te pozwalają określić skalę i sposób inwazji komórek w trójwymiarową macierz białkową. Przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjny test inwazji Transwell, jest możliwość uzyskania danych zarówno ilościowych, jak i jakościowych na temat inwazji komórek w trójwymiarową macierz białkową.

Moja współpracowniczka, Diane Creighton, zaprezentuje teraz metodę hodowli komórek pakujących retrowirusy w DMEM zawierającym 10% FBS przez 48 godzin. Następnie należy przeprowadzić transfekcję komórek DNA retrowirusowym zgodnie z instrukcjami producenta. Po inkubacji przez 24 godziny studzienki należy dwukrotnie wypłukać medium, a następnie dodać 1.5 milliliters 10% FBS-DMEM na studzienkę i inkubować przez 48 godzin w celu zebrania spakowanego retrowirusa.

Przenieś pożywkę do hodowli tkankowych do probówek do mikrocentryfugi o pojemności dwóch mililitrów, odwiruj w celu osadzenia komórek i zbierz nadsącz do czystej probówki. Przechowuj ten zapas retrowirusa w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić transdukcję retrowirusową komórek, usuń pożywkę z hodowli inkubowanej przez noc i dodaj jeden mililitr zapasu retrowirusa z dodatkiem poly green.

Po sześciogodzinnej inkubacji do dołka należy dodać 2 mL 10% F-B-S-D-M-E-M, a następnie umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C. W ciągu nocy należy uzupełnić pożywkę, a po 24 godzinach dodać odpowiednią pożywkę selekcyjną; po osiągnięciu konfluencji należy zebrać komórki i przeprowadzić sortowanie pod kątem fluorescencji, używając komórek nietransdukowanych jako referencji. Należy wyizolować komórki o fluorescencji wyższej niż w przypadku komórek nietransdukowanych i zamrozić alikwoty w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.

Metoda ta opiera się na ekspresji białek fluorescencyjnych w celu wizualizacji i pozwala na okreśenie wkładu poszczególnych komórek. Rozmrozić Matrigel na lodzie, a następnie rozcieńczyć w stosunku jeden do jednego w lodowatym PBS. Teraz umieścić niepowlekane transwelle w 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.

Następnie ostrożnie pipetuj 100 µL rozcieńczonego matri gel do dołków i pozostaw do stężenia w temperaturze 37 °C. W międzyczasie przygotuj zawiesiny komórek znakowanych fluorescencyjnie w ich standardowej pożywce wzrostowej. Po stężeniu matri gel odwróć transwelle i pipetuj 100 µL zawiesiny komórek na skierowaną w dół stronę wylotową filtra.

Ostrożnie przykryj transwellle dnem 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, tak aby stykała się ona z każdą kroplą zawiesiny komórkowej. Inkubuj płytkę w pozycji odwróconej przez cztery godziny, aby umożliwić adhezję komórek. Następnie odwróć płytki do pozycji prawidłowej i przemyj każdy transwell, zanurzając go dwukrotnie w 1 mL medium bezsurowiczego.

Następnie umieść transwell w trzecim dołku zawierającym leki lub odczynniki terapeutyczne. Ostrożnie nanieś pipetą 100 µL medium zawierającego chemoatraktant do transwellu, na powierzchnię zestalonej mieszaniny matrigelu i PBS. Inkubuj przez trzy do pięciu dni w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2, aby zobrazować niefluorescencyjne komórki naciekające Matrigel.

Umieścić transwellle w nowych płytkach 24-dołkowych i nanieść pipetą 1 mL 4 µM roztworu Calcein AM na wierzch każdej wkładki z Matrigelu, pozwalając mu spłynąć po bokach i barwić próbkę od góry oraz od dołu. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 °C w uwilgotnionej atmosferze zawierającej 5% CO2. Następnie wykonać obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ta pierwsza metoda barwienia stylu życia pozwala na wizualizację trybów inwazji. Przenieś każdy transwell na nową płytkę 24-dołkową, nałóż 1 mL 4%paraform aldehydu i 0,2%triton X 100, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez pół godziny. Po trzykrotnym przemyciu 1 mL PBS dodaj RNAs A na 30 minut, a następnie przemyj dwukrotnie PBS w celu wizualizacji w stężeniu 0,01 mg/mL.

Jodek propidyny rozcieńczono w PBS i pozostawiono w temperaturze pokojowej w ciemności na 30 minut. Przemyto trzy razy PBS. Na tym etapie transwell w barwniku z jodkiem propidyny można przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności przez co najmniej miesiąc.

Druga metoda barwienia komórek wymaga utrwalenia, ale pozwala na szybszą kwantyfikację inwazji. Używając odwróconego mikroskopu konfokalnego, umieść transwell z niewielką ilością pozostałego PBS na dużym szkiełku nakrywnym, stosując obiektyw 20x bez imersji, a następnie wykonaj przekroje optyczne co 10 do 15 mikronów od dołu zatyczki z Matrigelu. Określ stopień inwazji, analizując poszczególne przekroje optyczne. Stwórz również obiekty trójwymiarowe przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, takiego jak Velocity, na podstawie wspomnianej serii przekrojów optycznych. Komórki zabarwiono za pomocą calcium AM.

Zgodnie z oczekiwaniami, liczba komórek migrujących w górę z filtra zmniejsza się wraz z odległością. Inwazję tę można poddać kwantyfikacji. Trójwymiarowe rekonstrukcje inwazji komórkowej zapewniają wizualne przedstawienie sposobu tej inwazji.

Jeśli komórki zostaną oznakowane poprzez ekspresję białek fluorescencyjnych, pozycje komórek każdego koloru można zwizualizować w rekonstrukcjach trójwymiarowych, jak pokazano na tym widoku z boku. Ponadto przekroje przez rekonstrukcję mogą dostarczyć informacji na temat mechanizmów molekularnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak wykorzystać ten test inwazji komórkowej, aby uzyskać więcej informacji o procesie ucieczki, niż jest to możliwe przy zastosowaniu standardowych metod.