Funkcjonalne obrazowanie wapnia w rozwijających się sieciach korowych

Ogólnym celem tego filmu jest zademonstrowanie sposobu pomiaru aktywności sieci w rozwijających się plastrach kory mózgowiej przy użyciu fluorescencyjnego wskaźnika wrażliwego na wapń. Plastry mózgu DY są przygotowywane z rozwijającej się kory entorynalnej młodego myszy. Zarówno neurony, jak i astrocyty są obciążone markerami zależnymi od wapnia.

Zmiany fluorescencji barwników zależnych od wapnia odzwierciedlają zmiany w aktywności komórkowej. Komórki neuronalne, w tym astrocyty, mikroglej i komórki śródbłonka, mogą być barwione przy użyciu specyficznych barwników markerowych. Aktywność sieci kory mózgu rejestruje się za pomocą wielofotonowego obrazowania poklatkowego; komórki w obrębie sieci wykrywa się poprzez wykonanie trójwymiarowego stosu obrazów w badanym obszarze.

Zmiany fluorescencji komórkowej w wielu komórkach mogą następnie zostać przeanalizowane w celu odczytania aktywności rozwijającej się sieci korowej. Charakterystycznym wzorcem aktywności w rozwijającym się układzie nerwowym jest spontaniczna zsynchronizowana aktywność sieciowa. Zsynchronizowaną aktywność obserwowano w wielu różnych rozwijających się regionach neuronalnych, w tym w nienaruszonym rdzeniu kręgowym, korze oraz w preparatach dysocjowanych kultur neuronalnych podczas okresów aktywności spontanicznej, kiedy neurony ulegają depolaryzacji i generują pojedyncze impulsy lub serie potencjałów czynnościowych, aktywując wiele kanałów jonowych, w tym napięciozależne kanały wapniowe, co prowadzi do napływu jonów wapnia.

Wysoko zsynchronizowaną aktywność lokalnych sieci mierzono przy użyciu elektrod polowych lub mat wieloelektrodowych. Umożliwiają one wysoką częstotliwość próbkowania czasowego, ale oferują niższą rozdzielczość przestrzenną ze względu na zintegrowany odczyt aktywności komórek. Rozdzielczość aktywności neuronalnej na poziomie pojedynczej komórki jest możliwa dzięki zastosowaniu elektrofizjologii patch-clamp pojedynczych neuronów w celu pomiaru częstotliwości wyładowań.

Zdolność do pomiarów w obrębie sieci jest jednak ograniczona do liczby neuronów poddanych jednoczesnemu patchowaniu, co zazwyczaj obejmuje tylko jeden lub dwa neurony. Zastosowanie zależnych od wapnia fluorescencyjnych barwników wskaźnikowych umożliwiło pomiar zsynchronizowanej aktywności w całej sieci komórek. Technika ta zapewnia zarówno wysoką rozdzielczość przestrzenną, jak i wystarczające próbkowanie czasowe do rejestracji spontanicznej aktywności rozwijającej się sieci.

Fluorescencyjne wskaźniki wrażliwe na wapń, takie jak ester URA 2:00 AM, zawierają grupy kwasu karboksylowego zdolne do wiązania jonów wapnia. Barwniki fluorescencyjne te są aktywowane przez określone długości fal światła, przy użyciu mikroskopii jednofotonowej lub dwufotonowej. Liczba fotonów emitowanych przez barwnik ulega przejściowej zmianie po związaniu wapnia.

Tę zmianę liczby fotonów lub fluorescencji określa się jako sygnał delta FF, który odpowiada zmianie poziomu wapnia w neuronie. Pomiar zmian w wskaźnikach wrażliwych na wapń jest użyteczną miarą odczytu wzorców aktywności sieci w rozwijających się komórkach. Witajcie, jestem Rianna Morty, a ja nazywam się Julie Abbots.

Reprezentujemy Katedrę Neurofizjologii Interpretacyjnej Uniwersytetu w Amsterdamie. Wykorzystujemy obrazowanie wapniowe do badania aktywności funkcjonalnej w rozwijającej się tkance kory mózgowej myszy, stosując wskaźniki wrażliwe na wapń w obrazowaniu wieloogniskowym. Celem tego krótkiego filmu jest zademonstrowanie, w jaki sposób metody te mogą być użyte do pomiaru wzorców aktywności zarówno spontanicznej, jak i wywołanej w rozwijających się sieciach układu nerwowego.

Szybko wyjmij mózg z czaszki młodej myszy, aby zminimalizować uszkodzenia obwodów neuronalnych. Przeprowadź wycinek mózgu w lodowatym roztworze do plastrów. Roztwór do plastrów zawiera chlorek choliny zamiast sodu powszechnie stosowanego w A TSF do rejestracji neuronalnej.

W tych eksperymentach przygotowujemy skrawki mózgu z kory enterycznej rozwijającego się mózgu mysiego. Umieść kawałek papieru filtracyjnego na dnie szalki Petriego i zwilż go kilkoma mililitrami A TSF. Przenieś mózg na kawałek papieru filtracyjnego.

Przeciąć półkule na pół za pomocą pojedynczego ostrza żyletki. Rozdzielić obie półkule. Jedną z nich umieścić z powrotem w lodowatym roztworze do cięcia wraz z pozostałą półkulą.

Usuń móżdżek za pomocą żyletki. Odchyl jedną półkulę w stronę linii środkowej i wykonaj cięcie na głębokość około jednego milimetra od powierzchni grzbietowej, prowadząc ostrze pod lekkim kątem w stronę końca rostralnego. Odwróć mózg.

Oczyścić świeżo ściętą powierzchnię za pomocą patyczka bawełnianego i metalnej szpatułki. Przenieść mózg na metalny blok do cięcia. Delikatnie zsunąć mózg ze szpatułki za pomocą patyczka bawełnianego na przyklejoną powierzchnię.

Wycinane są plastry mózgu o grubości 300 Micrometer; prędkości cięcia i częstotliwość ostrza dla młodej tkanki są zazwyczaj niższe niż te stosowane w przypadku tkanki starszej. Po wycięciu należy przenieść każdy plaster za pomocą pipety szklanej; plastry przenosi się do komory przechowawczej zawierającej natleniony A TSF w temperaturze pokojowej. A CSF zawiera wyższy stosunek magnezu do wapnia niż roztwór A CSF.

Przetoki przeznaczone do rejestracji pozostawia się na jedną godzinę w celu regeneracji. Aby wprowadzić do komórek wskaźnik zależny od wapnia lub marker specyficzny dla komórek, przetoki należy przenieść do komory w celu przeprowadzenia procedury barwienia. Choć dostępne są komory komercyjne, można łatwo złożyć taką komorę ze standardowego sprzętu laboratoryjnego przy bardzo niskim koszcie.

Do wykonania komory barwienia będą potrzebne następujące podstawowe wyposażenie laboratoryjne: dwie plastikowe szalki Petriego, jedna strzykawka 10 ml, odcinek rurki krzemionkowej, wkład do hodowli komórkowej z membraną półprzepuszczalną, superglue, trzy małe łączniki do rurek oraz cienka igła.

Przeciągnij odcinek rurki silikonowej przez otwór i uformuj pętlę wewnątrz małej szalki. Użyj superglue, aby uszczelnić otwarty koniec rurki. Następnie przyklej pozostałą część rurki do wewnętrznej ścianki małej szalki Petriego.

Umieść małą szalkę Petriego w centrum większej i przyklej ją na miejscu. Weź pozostały koniec rurki silikonowej i przećnij go przez mały otwór w ściance szalki Petriego. Za pomocą cienkiej igły wykonaj małe otwory w rurce silikonowej wewnątrz szalki Petriego.

Wykonaj otwory w równych odstępach, aby zapewnić równomierne łączenie gazowe. Używając podgrzanego skalpela, przygotuj dołek do hodowli komórkowej z membraną półprzepuszczalną. Odetnij górny 1 centymetr dołka, tak aby pozostało płytkie naczynie do przechowywania plastrów podczas inkubacji.

Umieść płytką szalkę w centrum małej szalki, otoczoną porowatymi rurkami krzemowymi. Wykonaj w pokrywie dużej szalki otwór o średnicy około od pół do jednego centymetra. Pobierz plastikową strzykawkę o pojemności 10 ml, używając podgrzanego skalpela.

Wykonaj skośne cięcie, aby usunąć końcówkę strzykawki. Na przetniętą powierzchnię rurki strzykawki nałóż superglue. Przyklej ją bezpośrednio nad otworem w pokrywie dużej szalki Petriego.

Do końcówki strzykawki przyłącz konektor rurki. Umieść płytką szalkę w centrum małej szalki Petriego, upewniając się, że porowata rurka gazowa otacza szalkę. Rurkę tę należy następnie podłączyć do źródła gazu carbogen w celu natlenienia skrawków.

Podczas inkubacji przykryj dużą szalkę pokrywką, która jest również bezpośrednio połączona z dopływem gazu za pomocą końcówki strzykawki. Zapewni to dopływ gazu nad skrawkami podczas inkubacji, aby zapobiec fotowyblakaniu barwnika. Wszystkie procedury są wykonywane przy minimalnym oświetleniu, a zarówno barwnik, jak i skrawki są przechowywane w ciemności.

Napełnij komorę barwiącą około półtora mililitra A TSF za pomocą uchwytu do skrawków. Włóż do środka komorę interfejsową i dolej kolejny mililitr A TSF. Ważne jest utrzymanie odpowiedniej podaży tlenu, aby zachować żywotność tkanki i zapewnić prawidłowe załadowanie skrawka.

Barwienie odbywa się w temperaturze około 35 °C, aby ułatwić wchłanianie barwnika przez neurony podczas nagrzewania komory barwiącej. Przygotuj barwnik wskaźnikowy dla fira 2:00 AM Ester. Dodaj 9 µL DMSO oraz 1 µL kwasu onicowego do fiolki zawierającej 50 µg substancji.

DMSO i kwas onicowy. Działają jako środki zwiększające przepuszczalność, aby umożliwić przenikanie barwnika przez błonę lipidową. Wstrząsaj fiolką w wirówce (vortex) przez 15 minut, aby upewnić się, że barwnik został całkowicie rozpuszczony.

W celu przeprowadzenia barwienia przenieś każdy przekrój do interfejsu. Włóż go do komory barwiącej. Naniesienie barwnika bezpośrednio na obszar zainteresowania nad przekrojami, a następnie zamknij pokrywę komory barwiącej.

Pozostawić przekroje do inkubacji w ciemności przez 20 do 40 minut, w zależności od wieku myszy. Po inkubacji przenieść przekroje z powrotem do uchwytu, aby wypłukać resztki nadmiaru barwnika. Protokoły barwienia do obrazowania wapnia można również dostosować do starszych tkanek.

Wymaga to dodatkowego etapu preinkubacji. Przenieś stare plastry do płytkiej naczynia do preinkubacji wypełnionego trzema mililitrami CSF oraz ośmioma mikrolitrami roztworu crema four w stężeniu 0,5%. Podgrzewaj do 35 °C przez trzy minuty. Następnie przenieś plastry na powierzchnię styku, umieść je w komorze barwiącej i postępuj zgodnie z normalnymi procedurami barwienia.

Możliwe jest również barwienie tych przekrojów w celu uwidocznienia komórek pozah neuronalnych, a mianowicie astrocytów, mikrogleju i komórek śródbłonkowych. Do barwienia astrocytów można wykorzystać sulforodaminę 1 0 1. Należy przygotować roztwór o stężeniu 10 µM, a następnie nanieść fioletowy barwnik pipetą na obszar zainteresowania w przekrojach.

Pozostawić do inkubacji na 15 minut. Przenieść skrawki z powrotem do komory przechowawczej, aby usunąć nadmiar barwnika. Konjugat FSE lektyny pomidorowej może służyć do barwienia mikrogleju oraz komórek śródbłonka.

W przypadku lektyny pomidorowej należy przygotować roztwór o stężeniu 20 µg/ml. Nanieście barwnik na obszar zainteresowania w preparatach. Pozostawcie preparaty do inkubacji na 45 minut.

Następnie przenieś skrawki raz jeszcze do komory przechowawczej. Podczas obrazowania skrawki muszą pozostawać stabilne pod mikroskopem. Zazwyczaj do przytrzymania tkanki stosuje się metalową harfę, jednak może ona nierównomiernie zniekształcać powierzchnię skrawka, co prowadzi do ograniczenia pola widzenia pozostającego w ostrości podczas obrazowania, czego należy unikać.

Próbki tych plastrów są przytwierdzane do komory pomiarowej za pomocą roztworu POLIETYLENOIMIDYNY (PEI). PEI to polimer stosowany w celu zwiększenia adhezji komórek do powierzchni przez co najmniej jedną godzinę. Przed umieszczeniem plastrów w komorach pomiarowych, należy wypełnić komory kilkoma mililitrami roztworu PEI, aby pokryć dno komory.

W pierwszej kolejności wypłucz PEI z komory wodą destylowaną, a następnie roztworem A CSF. Przenieś skrawka do komory rejestracyjnej i usuń nadmiar roztworu A CSF. Za pomocą cienkiego pędzla ustaw skrawka w środku komory.

Usuń pozostały płyn A CSF za pomocą małych kawałków chłonnego papieru filtracyjnego. Należy upewnić się, że wokół krawędzi skrawka nie ma już płynu A CSF. Na koniec delikatnie nanieś 0,5 mL płynu A CSF na skrawek, uważając, aby nie poluzować go w komorze.

Umieść komory w dużym nasyconym tlenem pojemniku interfejsowym i pozostaw na kolejną godzinę w ciemności. Zmiany w barwnikach wskaźnikowych wrażliwych na wapń można rejestrować za pomocą mikroskopii jednofotonowej lub dwufotonowej. W naszych sieciach neuronalnych do obrazowania dwufotonowego wykorzystujemy laser tytanowo-szafirowy sprzężony z mikroskopem Olympus.

Dodatkowo wykorzystujemy system L Vision biotech trim scope z kamerą EM CCD hammer MATSU w celu uzyskania wyższych częstotliwości skanowania klatek. Umieść komorę z plastrem pod mikroskopem, zapewniając stabilny przepływ natlenionego A-T-S-F-A-T-S-F zawierającego 1,6 mM wapnia i 1,5 mM magnezu, podgrzewanego w układzie do około 30 °C przy użyciu światła białego.

Zlokalizuj interesujący obszar w przekroju i ustaw ostrość na powierzchni. Wyłącz światło i zamknij drzwi szafki do rejestracji, aby zmniejszyć poziom światła tła.

Dostępnych jest wiele różnych komercyjnych lub otwartych pakietów oprogramowania do rejestracji i analizy obrazów. W naszym laboratorium do akwizycji obrazów wykorzystujemy oprogramowanie inspector firmy Lavis Biotech. Aby rozpocząć obrazowanie, wybierz tryb kamery CCD dla detekcji. Ustaw długość fali odpowiednią dla stosowanego wskaźnika.

W przypadku fira 2:00 AM Ester, w oprogramowaniu trim scope ustawiamy wzbudzenie na 820 nanometrów. Wybieramy tryb skanowania 64 B. Wybieramy optymalną wielkość pola widzenia oraz rozdzielczość pikseli dla interesującego nas obszaru.

Wybierz odpowiednią liczbę klatek na sekundę oraz opcję obrotu pikseli (pixel spinning), jeśli jest ona wymagana dla próbkowania obrazu. Otwórz migawkę lasera w celu przygotowania do obrazowania ciągłego. Korzystaj z trybu obrazowania ciągłego.

Dostosuj wzmocnienie oraz intensywność lasera i ustaw ostrość na sieci neuronalnej, którą chcesz zobrazować. Zatrzymaj skanowanie. Wybierz ustawienia time-lapse dla częstotliwości klatek i czasu trwania sekwencji.

Po obrazowaniu time-lapse wykonaj stos obrazów Z (Z stack), obejmujący obszar 20 µm powyżej i 20 µm poniżej, w odstępach 1 µm. Stos Z ten służy do detekcji komórek podczas analizy. Wyeksportuj zapisane pliki jako stos obrazów TIFF.

Podsumowując, zaprezentowaliśmy zastosowanie wskaźników wapnia do pomiaru synchronicznej spontanicznej aktywności sieci w rozwijającej się korze mózgowej. Więcej szczegółów dotyczących metodologii i odczynników znajduje się w arkuszach danych dołączonych do tego filmu, aby umożliwić wdrożenie tej techniki w Państwa laboratorium.