Potwierdzanie i odkrywanie szlaków metabolicznych poprzez znakowanie ¹³C aminokwasów proteinogennych

Celem niniejszego protokołu jest badanie metabolizmu bakteryjnego z wykorzystaniem analizy metabolicznej wspomaganej węglem 13. W pierwszej kolejności mikroorganizmy są hodowane w obecności znakowanych substratów węglowych, które są wbudowywane w białka mikrobiologiczne. Następnie mikroorganizmy są zbierane, a aminokwasy ekstrahowane, hydrolizowane i poddawane derywatyzacji.

Próbki nanosi się na chromatograf gazowy i spektrometr masowy (GCMS). Poprzez śledzenie ścieżek przejść atomów między metabolitami w sieci biochemicznej można określić funkcjonalne szlaki metaboliczne wykorzystywane przez drobnoustroje. Jestem Bertem Burla.

Metoda, którą tutaj przedstawiamy, może być stosowana jako uzupełnienie transkryptomiki i proteomiki w celu określenia szlaków metabolicznych u mikroorganizmów. Wykorzystaliśmy tę technikę do badania mikroorganizmów fotosyntetyzujących, takich jak sinice, pod kątem myotroficznego lub heterotroficznego wykorzystywania węgla. W tym filmie posłużymy się szczepem modelowym ANOTHE 5 1 1 42, aby zademonstrować zastosowanie znakowanych substratów węglowych w odkrywaniu nowych funkcji enzymatycznych.

Procedurę zaprezentujemy ja, li Yu oraz Chu Yang Fang. Rozpocznij tę procedurę od hodowli bakterii cyana thesei w nieoznakowanym medium. Gdy bakterie osiągną środkową fazę logarytmicznego wzrostu, zaszczep 3% objętości do medium znakowanego węglem 13.

Następnie, aby uniknąć wprowadzenia nieznakowanego węgla z początkowej subkultury szczepionki do tego samego znakowanego medium w środkowej fazie wzrostu logarytmicznego, gdy bakterie Cy Thesei znakowane węglem 13 osiągną środkową fazę wzrostu logarytmicznego, należy zebrać 10 mililitrów poprzez wirowanie. Osad należy resuspender w 1,5 mililitrach kwasu solnego o stężeniu sześć molar i przenieść do przeźroczystej szklanej fiolki z zakrętką do chromatografii gazowej lub GC.

Zakręć fiolki i umieść je w piecu nagrzanym do 100 °C na 24 godziny, aby przeprowadzić hydrolizę białek biomasy do aminokwasów. Hydroliza pelletów biomasy pozwala na uzyskanie 16 z 20 powszechnie występujących aminokwasów. Po hydrolizie przenieś roztwór aminokwasów do probówek do mikrowirówki o pojemności 2 mL, a następnie wiruj przy 20 000 ×g przez pięć minut w celu osadzenia cząstek stałych.

Po wirowaniu przenieś nadosady do nowych fiolek do GC, aby usunąć cząstki stałe z roztworu hydrolizy, zapobiegając ich przedostaniu się do kolumny GC. Następnie aminokwasy są poddawane derywatyzacji, aby uczynić je lotnymi dla rozdzielenia metodą chromatografii gazowej. Próbki po wysuszeniu rozpuść w 150 µL tetrahydrofuranu (THF) oraz 150 µL N,O-bis(trimetylsilylo)trifluoroacetamidu (BSTFA).

Odczynnik do derywatyzacji acetamidem, T-B-D-M-S: wszystkie próbki inkubować w piecu w temperaturze od 65 do 80 °C przez jedną godzinę. Próbki należy sporadycznie mieszać w wstrząsarce typu vortex, aby upewnić się, że metabolity w fiolce są rozpuszczone. Próbki wirować przy 20 000 ×g przez 10 minut, a następnie przenieść nadsącz do nowych fiolek do GC.

Nadlodówka powinna być klarownym, żółtawym roztworem. Parametry temperatury GC są następujące: utrzymanie 150 °C przez dwie minuty, następnie wzrost z prędkością 3 °C na minutę do 280 °C.

Zwiększać temperaturę w tempie 20 °C na minutę do 300 °C, a następnie utrzymać ją przez pięć minut. Następnie, w przypadku 30-metrowej kolumny GC, ustawić opóźnienie rozpuszczalnika na około pięć minut, a zakres stosunku masy do ładunku w przedziale od 60 do 500. Próbki analizować za pomocą GCMS, stosując objętość wtrysku 1 µL przy stosunku podziału od 1:5 do 1:10 oraz gaz nośny hel w przepływie 1,2 mL na minutę po zakończeniu cyklu.

Przeanalizuj dane z GCMS za pomocą programu Microsoft Excel. Czas retencji w GC oraz unikalne piki stosunku masy do ładunku dla każdego aminokwasu przedstawiono na tej figurze. Pochodne T-B-D-M-S aminokwasów są zazwyczaj wyraźnie rozdzielane przez MS na dwa naładowane fragmenty: fragment M minus 57, który zawiera cały aminokwas, oraz fragment M minus 1 59, w którym brakuje grupy alfa-karboksylowej aminokwasu w przypadku leucyny i izoleucyny.

ピк M minus 57 nakładał się na inne piki masowe fragmentów. Fragment N minus 15 może być wykorzystany do analizy całego znakowania aminokwasów. Ponadto grupa F 3 0 2 jest często wykrywana w większości aminokwasów i zawiera jedynie pierwszą grupę alfa-karboksylową oraz drugi węgiel w szkielecie aminokwasu.

Jednakże, ponieważ ten pik Ms.Peak często charakteryzuje się wysokim stosunkiem szumu do sygnału, F 3 0 2 nie jest zalecany do ilościowej analizy strumieni metabolicznych. Deriwatyzacja aminokwasów lub głównych metabolitów wprowadza znaczne ilości naturalnie znakowanych izotopów, w tym węgla 13, tlenu 18, krzemu 29 oraz krzemu 30. Szum pomiarowy wynikający z obecności izotopów naturalnych w surowym widmie mas lub izotopowym może zostać skorygowany przy użyciu opublikowanego oprogramowania.

Końcowe dane dotyczące znakowania izotopowego przedstawiono jako ułamki masowe. Na przykład M zero, M1, M dwa, M trzy oraz M cztery, reprezentujące fragmenty zawierające od zera do czterech atomów węgla znakowanych izotopem węgla 13 cyana. Ten 5 1 1 2 nie zawiera enzymu lianina amoniak-liazy, który katalizuje konwersję lianiny do 2-ketobutyranu w typowej ścieżce syntezy izli.

W związku z tym, aby rozstrzygnąć kwestię szlaku metabolicznego w tym organizmie, szczep cyana THESEI 5 1 1 42 był hodowany w medium ASP two z 54 mM glicerolu i analizowany za pomocą GCMS, zgodnie z opisem w tym filmie. Jak pokazano tutaj, Cyana Thesei 5 1 1 4 2 wykorzystuje glicerol znakowany w drugiej pozycji jako główne źródło węgla; zaobserwowano, że treonina i alanina, których prekursorem jest pirogronian, posiadają jeden znakowany węgiel, podczas gdy izoleucyna została znakowana trzema węglami. Zatem synteza w cyana these 5 1 1 4 2 nie może pochodzić ze szlaku treoninowego stosowanego przez większość organizmów. Z drugiej strony, leucyna i izoleucyna wykazują identyczne wzory znakowania w oparciu o fragment M minus 15 oraz fragment M minus 1 59.

Na przykład izotop lub dane z N minus 15 zawierające NIEPOODZIELONE aminokwasy wykazały identyczne znakowanie dla leucyny i izoleucyny. Zatem leucyna i izoleucyna muszą być syntetyzowane z tych samych prekursorów, pirogronianu i acetylo-CoA. Obserwacja ta jest zgodna z przejściem znakowanego węgla w szlaku cytramalatu dla syntezy izoleucyny.

Metodę tę można wykorzystać do badania metabolizmu szerokiego spektrum mikroorganizmów, a po opanowaniu techniki cały proces można przeprowadzić od początku do końca w około jeden tydzień.