Powtarzalny model zmiażdżenia nerwu kulszowego myszy i późniejsza ocena regeneracji poprzez analizę całego preparatu mięśnia
22 lutego 2012
W niniejszym raporcie opisujemy metodę zmiażdżenia nerwu kulszowego u myszy. Metoda ta wykorzystuje powszechnie dostępne kleszczyki hemostatyczne i pozwala w prosty oraz powtarzalny sposób uzyskać całkowite zmiażdżenie nerwu kulszowego. Ponadto opisujemy metodę przygotowania preparatów całych mięśni, odpowiednich do analizy regeneracji nerwów po zmiażdżeniu nerwu kulszowego.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie prostej, powtarzalnej metody zmiażdżenia nerwu kulszowego oraz analiza całego preparatu w celu oceny reinnerwacji mięśni po zmiażdżeniu nerwu kulszowego. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez uprzednie odsłonięcie nerwu kulszowego, z uwzględnieniem właściwego rozmieszczenia retraktorów chirurgicznych w celu zapewnienia dobrego dostępu do nerwu. Następnie nerw zostaje zmiażdżony za pomocą kleszczyków hemostatycznych i oznakowany węglem aktywnym.
Następnie należy usunąć poszczególne mięśnie unerwione przez nerw kulszowy z kończyny tylnej. Ostatnim krokiem jest wypreparowanie poszczególnych mięśni do analizy w preparatach całych (whole mount) po barwieniu immunologicznym. Ostatecznie wyniki wykazują, że powtarzalne zmiażdżenie nerwu kulszowego można przeprowadzić w prosty sposób, a preparaty całych mięśni mogą być wykorzystane do analizy późniejszej regeneracji.
Główną zaletą tej procedury jest to, że zapewnia ona prostą i powtarzalną technikę zmiażdżenia nerwu kulszowego, a następnie oceny regeneracji aksonów. Rozpocznij procedurę od znieczulenia myszy do operacji, stosując koktajl złożony z 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny poprzez wstrzyknięcie doszpikowe, aby zminimalizować ból pooperacyjny. Mysz otrzymuje również podskórny zastrzyk z 10 mg/kg meloksykamu.
Następnie ostrożnie ogoli obie tylne ćwiartki ciała za pomocą trymiera chirurgicznego. Po tym zastosuj krem do usuwania włosów z nozdrzy w celu całkowitego ich usunięcia. Oczyść skórę za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianym końcem i chirurgicznego preparatu do mycia Betadine.
Następnie, za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką, nanieś maść okulistyczną do oczu. Umieść mysz na czystej płycie ze stali nierdzewnej na rozgrzanym kocu homeotermicznym i utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 °C. Następnie przymocuj wszystkie kończyny taśmą.
Starannie i symetrycznie ustaw kończynę tylną tak, aby staw kolanowy tworzył kąt prosty z ciałem. Następnie, pod mikroskopem, przykryj pole operacyjne sterylną obłożeniem. Wykonaj półkoliste nacięcie wzdłuż linii środkowej.
Delikatnie oddziel skórę od leżącej pod nią muskulatury, od czasu do czasu ją odkładając. Aby utrzymać wilgotność pola operacyjnego podczas procedury, aplikuj około 0.1 milliliters sterylnej soli fizjologicznej. Następnie otwórz płaszczyznę powięziową między mięśniem pośladkowym wielkim a głową przednią mięśnia dwugłowego uda.
Aby odsłonić nerw kulszowy w celu wykonania kontroli chirurgicznej. Przeciwległy nerw kulszowy należy odsłonić i zmobilizować, pozostawiając go jednak nienaruszonym. Następnie należy przywrócić na miejsce i zaszyć mięśnie pośladkowe.
Odsłoń eksperymentalny nerw kulszowy w ten sam sposób, używając retraktorów. Aby ułatwić wizualizację, delikatnie uwolnij nerw kulszowy z otaczającej go tkanki łącznej, używając nożyczek do irydektomii.
Następnie użyj precyzyjnych pęsety 5 45, aby umieścić nerw w dolnym zgrywie superprecyzyjnych kleszczyków hemostatycznych, ustawiając trzy powięzie obok siebie, a nie jedna na drugiej. Kleszczyki hemostatyczne posiadają nacięcie w odległości 1,5 milimetra od ich końcówki. Przed zmiażdżeniem ustaw zewnętrzną część nerwu kulszowego w linii z tym oznaczeniem.
Zapewnia to zmiażdżenie o jednolitej szerokości oraz gwarantuje, że nerw nie wyjdzie poza szczęki kleszczyków hemostatycznych podczas spłaszczania pod wpływem siły nacisku. Jeśli nerw wyjdzie poza końcówki kleszczyków, zostanie on zmiażdżony tylko częściowo. Użyj drugiej pary kleszczyków hemostatycznych, które zostały wcześniej zanurzone w węglu w proszku, aby zaznaczyć miejsce zmiażdżenia.
Zmiażdż nerw w tym samym miejscu zgniatania przez 15 sekund przy trzech kliknięciach. Żadne oznaczenie węglowe nie powinno wykraczać poza granice pierwotnego zgniatania. Jest to szczególnie istotne, jeśli wymagane jest precyzyjne oznaczenie miejsca zgniatania, aby wcześniej zanurzyć pęsetę w węglu i zapobiec rozprzestrzenianiu się węgla w polu operacyjnym.
Otwórz kleszczyki w proszku węglowym. Następnie delikatnie je zamknij. Użyj sterylnej gazy, aby wytrzeć węgiel z zewnętrznych powierzchni kleszczyków hemostatycznych.
Sprawdź pęsetę pod co najmniej trzykrotnym powiększeniem, aby upewnić się, że powierzchnie zgniatające są równomiernie pokryte proszkowym węglem. W razie potrzeby należy je ponownie zanurzyć i wytrzeć; przywróć i zaszyj mięśnie pośladkowe w ten sam sposób, co po stronie przeciwległej. Na koniec zamknij nacięcie skóry, używając dziewięciomilimetrowych klipsów refleksyjnych.
Jeśli stwierdzono, że dziewięciomilimetrowe klipsy refleksyjne ograniczają ruchomość, można zastosować mniejsze klipsy refleksyjne lub sześć szwów automatycznych. Zamiast tego, po uśmierceniu myszy, należy ostrożnie usunąć cztery mięśnie kończyny tylnej: mięsień prostownik długi palców stopy, mięsień strzałkowy długi oraz mięsień płaszczowaty, przypinając je przez tkanki łączną do czarnej płytki powlekanej sardaem.
Następnie wypłucz je w PBS. Po tym utrwal je w 4% Paraformaldehydzie przez 30 minut. Aby wypreparować każdy mięsień na czarnej szalce Petriego powlekanej sardem, usuń z niego ścięgna za pomocą nożyczek do irydektomii.
Następnie odchudź mięśnie, ostrożnie oddzielając wewnętrzne włókna mięśniowe. Należy starannie zachować zewnętrzną powierzchnię mięśnia, w tym prążki końcowe. Następnie zamocuj otrzymane mięśnie na szkiełkach dodatnich, używając medium Vector Shield i szklanych szkiełek nakrywkowych o wymiarach 22 by 40 mm; dwa boki należy uszczelnić bezbarwnym lakierem do paznokci. Po prawidłowym zamocowaniu na szkiełku prążki końcowe powinny stykać się ze szkiełkiem nakrywkowym.
Oto przykład miejsca zmiażdżenia in situ w lewej tylnej kończynie. Miejsce zmiażdżenia zaznaczono czarnym węglem. Gwiazdka oznacza odgałęzienie nerwu piszczelowego, który unerwia mięśnie uda i służy jako użyteczny punkt orientacyjny.
Podczas operacji zmiażdżenia, gałąź piszczelowa nerwu kulszowego jest obrysowana na niebiesko, gałąź strzałkowa na zielono, a gałąź skórna na żółto. Ten półcienki przekrój przedstawia całkowite zmiażdżenie wykonane kleszczykami hemostatycznymi. Groty strzałek wskazują tutaj zmiażdżone włókna.
Niepełne zmiażdżenie wykonane za pomocą szczypiec kątowych przedstawiono na innym przekroju półcienkim. Groty strzałek ponownie wskazują zmiażdżone włókna, natomiast strzałki wskazują zachowane aksony. Są to wyrenderowane obrazy z mięśni w preparacie całego organu.
Po usunięciu tkanki łącznej i następnym rozcienieniu, na każdym mięśniu wyznaczono obszary prążków płytek motorycznych. Przedstawiony tutaj mięsień to kompletny preparat mięśnia kulszowo-goleniowego, 14 dni po zmiażdżeniu nerwu kulszowego.
Strzałki wskazują obszary złącza nerwowo-mięśniowego, które zostały ponownie zinnerwowane przez akson. Oto demonstracja zdenerwowanego złącza nerwowo-mięśniowego. Główki strzałek wskazują wypustki komórek Schwanna wykazujące pozytywną reakcję na GAP-43.
W tym pozbawionym unerwienia złączu nerwowo-mięśniowym nie obserwuje się aksonów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać praktyczną wiedzę na temat tego, jak w sposób powtarzalny miażdżyć nerwy statyczne oraz przygotowywać preparaty mięśni z hormonami do analizy regeneracji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy raport opisuje prostą i powtarzalną metodę zmiażdżenia nerwu kulszowego myszy oraz analizy reinnerwacji mięśni. Technika ta wykorzystuje powszechnie dostępne kleszczyki hemostatyczne do całkowitego zmiażdżenia nerwu i obejmuje przygotowanie preparatów całych mięśni do analizy regeneracji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Medycyna regeneracyjna
- Fizjologia mięśni
Wstęp
- Uszkodzenia nerwu kulszowego mogą prowadzić do znacznych deficytów motorycznych.
- Zrozumienie regeneracji nerwów jest kluczowe dla opracowania strategii terapeutycznych.
- Analiza całego preparatu (whole mount) pozwala na wgląd w reinerwację mięśni.
- Istniejące metody mogą charakteryzować się niską powtarzalnością i dostępnością.
Cel badania
- Zaprezentowanie powtarzalnej metody zmiażdżenia nerwu kulszowego.
- Przygotowanie całych preparatów mięśni do późniejszej analizy regeneracji nerwów.
- Dostarczenie przejrzystego protokołu, który może zostać łatwo przyjęty przez badaczy.
Zastosowane metody
- Odsłoń nerw kulszowy, używając rozieraków chirurgicznych.
- Zmiażdż nerw kleszczykami hemostatycznymi i oznacz go węglem.
- Usuń z kończyny tylnej poszczególne mięśnie unerwione przez nerw kulszowy.
- Przeprowadź sekcję mięśni w celu analizy całego preparatu po immunobarwieniu.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na spójne i całkowite zmiażdżenie nerwu kulszowego.
- Całe preparaty mięśni mogą być skutecznie analizowane pod kątem regeneracji.
- Wyniki wykazują wykonalność tego podejścia w badaniu naprawy nerwów.
- Otrzymane dane przyczyniają się do zrozumienia procesów reinerwacji mięśni.
Wnioski
- Ta metoda stanowi niezawodne narzędzie dla badaczy zajmujących się urazami nerwów.
- Analiza całego preparatu (whole mount analysis) jest wartościową techniką oceny reinnerwacji mięśni.
- Protokół ten można łatwo wdrożyć w różnych warunkach badawczych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Niniejsza metoda dostarcza powtarzalnego modelu do badania regeneracji nerwów obwodowych, umożliwiając mechanistyczną weryfikację i ograniczanie ryzyka w odniesieniu do celów terapeutycznych w przedklinicznych programach neuronaukowych. Dzięki standaryzacji zmiażdżenia nerwu kulszowego oraz ilościowemu określeniu reinerwacji poprzez analizę całych preparatów mięśniowych, metoda ta wspomaga walidację celów oraz rozwój testów dla kandydatów o działaniu neuroprotekcyjnym lub neuroregeneracyjnym. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania leków, łącząc wzrost aksonalny z odczytami funkcjonalnej reinerwacji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych dotyczących regeneracji aksonów i oddziaływań komórek Schwanna w genetycznie podatnym modelu.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje powszechnie dostępne linie myszy transgenicznych do analizy mechanizmów molekularnych naprawy nerwów z wysoką powtarzalnością.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe wyniki obrazowe (np. reinnervację złącza nerwowo-mięśniowego) do wysokoprzepustowego przesiewania bibliotek związków.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje znakowanie miejsca zmiażdżenia oraz przygotowanie mięśnia, aby zapewnić spójność testów pomiędzy laboratoriami i punktami czasowymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez modelowanie aksonotomezy, istotnego klinicznie uszkodzenia nerwu obwodowego.
- Wartość operacyjna: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu, skorygowane o ryzyko, dzięki podłużnej korelacji struktury i funkcji procesu regeneracji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywczego – od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych po identyfikację wiodących związków (lead identification), zapewniając system istotny z punktu widzenia choroby do oceny leków biologicznych lub małych cząsteczek ukierunkowanych na wspomaganie regeneracji nerwów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków i funkcjonalną walidację punktów uchwytu poprzez umożliwienie precyzyjnego pomiaru kinetyki regeneracji aksonalnej.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy preparatów tkankowych z mierzalnymi zmiennymi zależnymi (np. prążki reinerwowane w płytkach motorycznych) do oceny efektów działania związków.
- Analityka: Generuje wyniki statystyczne z obrazowania całych preparatów, co pozwala na porównanie skuteczności regeneracji w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewniają ciągłość przedkliniczną dzięki zastosowaniu modelu gryzoni, który jest prognostyczny dla odpowiedzi na uszkodzenia nerwów obwodowych u ludzi.
- Powtarzalność w przedsiębiorstwie: Tworzy zstandaryzowaną, skalowalną platformę do wielokrotnego wykorzystania w kampaniach ograniczania ryzyka punktów uchwytu oraz optymalizacji związków wiodących.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu poprzez bezpośrednią wizualizację interakcji między aksonem, komórką Schwanna a błoną podstawną.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji siły zmiażdżenia, znakowania miejsca oraz protokołu przygotowania preparatu całego mięśnia.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie obiektywnych, opartych na histologii parametrów regeneracji na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów do neuroregeneracji z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o dane dotyczące funkcjonalnej reinerwacji.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgii, preparatyki tkanek oraz barwienia immunofluorescencyjnego.
- Zależy od dostępu do stereomikroskopów, kleszczyków hemostatycznych oraz systemów obrazowania do analizy preparatów całych (whole mount).
- Wymaga standaryzacji czasu zgniatania, techniki znakowania oraz momentu utrwalania mięśni pomiędzy zespołami badawczymi.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania modelu przy zastosowaniu go u różnych szczepów myszy lub różnego tła genetycznego.
- Ograniczone koniecznością przeprowadzenia procedur terminalnych oraz wymogiem fachowej obsługi w celu zachowania powtarzalności zgniatania i precyzji znakowania.
