Mikrokapsułka alginianowa jako trójwymiarowa platforma do propagacji i różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w różne linie komórkowe

Niniejszy protokół został zoptymalizowany pod kątem enkapsulacji pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich różnicowania w neurony dopaminergiczne w systemie 3D. Najpierw należy potraktować kolonie inhibitorem ROCK (RI), a następnie rozbić je do pojedynczych komórek, zmieszać z alginianem sodu i przepuścić przez urządzenie do enkapsulacji. Kontynuować podawanie RI przez trzy dni, a następnie przenieść zenkapsulowane komórki na podłoże PA6 i różnicować przez 28 dni.

Ostatecznie analiza ekspresji genów i białek wykazała wyższą wydajność generowania neuronów dopaminergicznych. Główną zaletą tej konkretnej techniki w porównaniu z istniejącym protokołem różnicowania 2D jest to, że staramy się namnażać i różnicować te komórki w środowisku 3D, a środowisko 3D stwarza możliwość namnażania komórek przy zachowaniu wysokiej gęstości. Zapewnia to również szansę na lepsze oddziaływania międzykomórkowe sprzyjające różnicowaniu.

Po trzecie, zapewnia to również lepszą wydajność różnicowania w dalszych etapach. Pragnę także dodać, że tę konkretną technikę można zaadaptować do innych typów komórek, które możemy namnażać w środowisku 3D. Należy również pamiętać, że na przykład ta konkretna technika została zoptymalizowana pod kątem zastosowania określonego inhibitora ROCK, który zapobiega apoptozie komórek, a także zapobiega ich odrywaniu się od naczyń hodowlanych.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają na początku trudności, ponieważ technika ta nie jest typowo stosowana w hodowlach tkankowych. Poniższa technika enkapsulacji została zoptymalizowana na podstawie badań podsumowujących przeprowadzonych przez Dr.Dean Dr.Chad w zakresie zastosowania alginianu typu inhibitor R, stężenia alginianu oraz ustawień urządzenia do enkapsulacji. Jamie oraz Kim, doktorantka z naszego laboratorium, zaprezentują teraz ten protokół.

Do 275 mg oczyszczonego alginianu sodu w sterylnej probówce o pojemności 50 ml dodać 25 ml sterylnego 0,1% roztworu żelatyny, a następnie wymieszać w wstrząsaczu wirówkowym (vortex), aby częściowo rozpuścić proszek alginianu. Następnie umieścić probówkę na mieszadle orbitalnym przy 10 ×g przez noc. W kolejnym kroku do roztworu alginianu dodać 9% sterylny chlorek sodu.

Mieszać w vortexie przez 30 sekund, a następnie wirować z przyspieszeniem 95 ×g przez pięć minut. Roztwór alginianu przechowywać w temperaturze 4 °C. W ciemności przeprowadzić wstępną inkubację ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w pożywce hodowlanej uzupełnionej o 10 µM inhibitora ROCK.

Inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 °C. Następnie przemyć komórki dwukrotnie DPBS, aby usunąć je enzymatycznie. Dodać accutane i inkubować przez 10 minut.

W temperaturze 37 °C ostrożnie zbierz komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieś je do probówki o pojemności 15 ml. Zneutralizuj Accutane równą objętością medium SL. Następnie przepuść zneutralizowane komórki przez filtr 40 µm do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.

Następnie należy użyć hemocytometru do zliczenia komórek. Komórki należy osadzić przez wirowanie, a nadsącz ostrożnie odlać. Następnie komórki należy raz przemyć podgrzanym roztworem.

0,9% chlorek sodu. Odwiruj osad i odrzuć nadosad. Aby enkapsulować ludzkie embrionalne komórki macierzyste, rozpocznij od resuspensji komórek w podgrzanym roztworze alginianu.

Aby to zrobić, należy podłączyć strzykawkę o pojemności 20 ml do miękkiego plastikowego wężyka i zassać do niej alginian. Następnie delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową za pomocą strzykawki, uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza. Teraz należy zassać komórki do strzykawki.

Wyrzuć plastikowy przewód, a następnie podłącz strzykawkę do urządzenia do enkapsulacji. Przejdź do konfiguracji instrumentów: generatora kuleczek, pompy strzykawkowej, przepływomierza powietrza oraz kąpieli wytrącającej z chlorkiem wapnia. Upewnij się, że między końcem urządzenia do enkapsulacji a punktem zbierania w szalce Petri znajduje się odstęp 10 centimeter.

Następnie ustaw pompę strzykawkową na 10 milliliters per hour. Przepływ powietrza ustaw na eight liters per minute, a ciśnienie na 100 kilo pascals. Zbieraj enkapsulowane komórki do wstępnie podgrzanej kąpieli wytrącania przez siedem minut.

Następnie przenieś je delikatnie poprzez aspirację do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml 0.9% Sodium chloride. Pozostaw kapsułki do momentu, aż osiądą na dnie probówki, ostrożnie odlej nadsącz, a następnie przemyj raz 0.9% Sodium chloride. Przejdź do resuspensji inkapsulowanych komórek w uprzednio ogrzanym medium hodowlanym z dodatkiem inhibitora ROCK. Przenieś zawiesinę do kolby hodowlanej i inkubuj przez trzy dni.

Wysiej linię komórek zrębowych myszy PA six w kolbie T 75 powleczonej 0,1% żelatyną i inkubuj w medium do różnicowania neuronów dopaminergicznych warunkowanym przez komórki PA six przez 24 godziny. Przenieś kapsułki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i pozwól im opaść na dno probówki. Odlej nadsącz i resuspenduj kapsułki w medium do różnicowania neuronów dopaminergicznych warunkowanym przez komórki PA six.

Kultura w pożywce. Enkapsułowane ludzkie embrionalne komórki macierzyste wraz z monowarstwą komórek PA six przez 21 dni. Wymiana pożywki podczas jej uzupełniania.

Za każdym razem wymieniaj tylko połowę pożywki, aby kontynuować hodowlę sześciu komórek PA w procesie różnicowania w kierunku neuronów dopaminergicznych. Pożywkę uzupełnia się czynnikami indukującymi przez jeden tydzień. Najpierw odessaj kapsułki i przenieś je do probówki do wirowania o pojemności 15 mililitrów.

Gdy kapsułki osiądą na dnie, odlej nadsącz. Przemyj dwukrotnie DPBS, odlewając nadsącz. Następnie dodaj pięć mililitrów roztworu dekapsulującego i dokładnie wymieszaj zawiesinę.

Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu osadu, zdekapulować komórki i przepłukać dwukrotnie DPBS, a następnie wykorzystać zdekapulowane komórki w hodowli monowarstwy lub do natychmiastowej analizy w dalszych etapach. W typowym przygotowaniu średnica mikrokapsułek alginianowych wynosi od 400 do 500 mikronów.

Tutaj zastosowano test C-F-D-A-P-I. Wyniki określają liczbę żywych zielonych komórek enkapsulowanych przy 80% analizach żywotności, proliferacji i apoptozy enkapsulowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w różnych punktach czasowych, co służy optymalizacji warunków hodowli. Co ciekawe, efekty inhibitora ROCK zapobiegają apoptozie indukowanej dysocjacją i utrzymują żywotność komórek, wskazując na lepszy wzrost enkapsulowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych hodowanych w H-F-F-C-M z dodatkiem ri.

Niniejszy przykład wykorzystuje enkapsulację komórek jako platformę 3D do różnicowania enkapsulowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w neurony dopaminergiczne. Zgodnie z oczekiwaniami, rozmiar ciał embrionalnych zwiększa się wraz z czasem; po dekapsulacji komórki wykazują postępującą morfologię neuronalną po dwóch do trzech dniach hodowli, przy żywotności przekraczającej 90%. Analiza ekspresji genów wskazuje na obniżenie poziomu ekspresji markera pluripotencji OCT four.

Co istotne, marker progenitorów neuronalnych PAX6 oraz marker neuronów dopaminergicznych TH pozostają podwyższone po siedmiu dniach różnicowania. Dalsze różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych wskazuje na obecność ponad 90% neuronów TH-dodatnich po 21 dniach. Analiza Western blot potwierdza korzystne wzorce ekspresji TH i PAX6 w systemach hodowli komórkowej 3D w porównaniu z 2D.

Po opanowaniu, technikę tę można efektywnie przeprowadzić w ciągu dwóch godzin. Należy pamiętać o traktowaniu komórek inhibitorem ROCK przed i po enkapsulacji. Induktory lub inhibitory wariantów mogą pozwolić na dostosowanie protokołu różnicowania 3D do przyszłych eksperymentów.

Ta konkretna technika enkapsulacji ludzkich ESL i ich różnicowania w środowisku 3D służy do badania potencjału w terapii komórkowej wielu chorób, w szczególności choroby Parkinsona.