Produkcja macierzy mikrotkankowych, barwienie immunohistochemiczne i digitalizacja w ramach projektu Human Protein Atlas
31 maja 2012
Mikromacierze tkankowe stanowią efektywną metodę jednoczesnego pozyskiwania informacji z wielu tkanek. Reprezentatywne fragmenty tkanek są łączone w jednym bloku parafiny. Przekroje z bloku wykorzystuje się do immunohistochemii oraz analizy wzorców ekspresji białek. Skanowanie cyfrowe pozwala na wygenerowanie odpowiadających im obrazów w celu dystrybucji danych.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie wydajnej metody pozyskiwania jednoczesnych informacji o ekspresji białek z wielu tkanek w ramach projektu o wysokiej przepustowości, takiego jak Human Protein Atlas. Cel ten osiąga się poprzez wybór reprezentatywnych obszarów tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie. Następnie z zaznaczonych obszarów wycinane są rdzenie, które są następnie łączone w jednym bloku parafiny, tworząc macierz tkankową (TMA).
Następnie z TMA wycina się sekcje i przeprowadza immunohistochemię. Na koniec analizowany jest wzorzec ekspresji białek, a dane są publikowane w Human Protein Atlas. W rezultacie można uzyskać wyniki obrazujące ekspresję białek w tkankach i komórkach za pomocą mikrotablic tkankowych oraz immunohistochemii.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykonywanie immunohistochemii z pojedynczych bloków tkanki miąższowej, jest możliwość oszczędzenia cennego materiału biologicznego oraz większa powtarzalność eksperymentów. Inną zaletą tej techniki jest możliwość obniżenia kosztów ENT, a także skrócenie czasu obróbki laboratoryjnej. Procedurę tę, mającą na celu uzyskanie zunifikowanej długości rdzeni tkankowych, zaprezentuje Ian call Bay, technik laboratoryjny z mojego laboratorium.
Zaznacz stilet. Zaleca się pozostawienie marginesów od 2,5 do 3,0 milimetra po każdej stronie bloku parafinowego, aby uniknąć pęknięcia parafiny podczas montażu odpowiednich wycinaków. Poluź śruby z imbusową głowicą utrzymujące wycinak na miejscu i ustaw go tak, aby rowek w piastie wycinaka ściśle przylegał do metalowego pręta w plastikowym bloku V.
Dokręć śruby, upewniając się, że krawędź metalowego klipsa jest pozioma. Wsuń wybijak biorcy po lewej stronie oraz wybijak dawcy po prawej stronie. Użyj pokręteł regulacji XY oraz ich cyfrowych odczytów mikrometrycznych, aby przesuwać wybijaki wzdłuż osi X i Y.
Aby zresetować urządzenie, naciśnij przycisk zero a BS, aby przełączać się między calami a milimetrami, naciskając przycisk inch millimeter. Przy użyciu przebijaka o średnicy 1 mm dla szablonu 9x8, odstęp między otworami powinien wynosić 2 mm, mierzony pomiędzy środkami otworów, aby zapobiec zbyt głębokiemu wciśnięciu przebijaka odbiorczego i jego uszkodzeniu. Ustaw maksymalną głębokość wciskania przebijaka, umieszczając pustą kasetę w uchwycie i korzystając ze śruby ograniczającej głębokość w lewym górnym rogu prowadnicy Z; ustaw pozycję dolną przebijaka odbiorczego na 1 mm powyżej dna kasety. Po wybraniu i oznaczeniu odpowiedniego obszaru na przekroju tkankowym oraz zaprojektowaniu szablonu do produkcji macierzy tkankowej (TMA), umieść blok odbiorczy w uchwycie i za pomocą najmniejszego śrubokręta dokręć śruby.
Należy unikać zbyt mocnego dokręcania śrub, aby zapobiec poluzowaniu się parafiny w kasecie. Przesunąć wybijak biorcy w dół na około pięć milimetrów w głąb bloku biorcy, a następnie za pomocą uchwytu wybijaka obracać go w przód i w tył. Następnie powoli zmniejszyć nacisk w dół, aby sprężyny mogły przesunąć wybijak do góry.
Użyj stylu, aby opróżnić stemplownik i usunąć rdzeń parafinowy. Następnie przemieść obrotowy uchwyt, aby przełączyć na stemplownik dawcy. Następnie umieść mostek bloku dawcy z blokiem dawcy nad uchwytem bloku biorcy.
Użyj odpowiedniego preparatu barwionego hematoksyliną i eozyną, na którym zaznaczono obszar zainteresowania, aby zlokalizować tkankę przeznaczoną do pobrania. Przytrzymaj ręcznie blok dawcy w pozycji lewą ręką i wciśnij stempel prawą ręką. Nie naciskaj na prowadnik. Ogranicznik głębokości nie blokuje ruchu stempla w odpowiedniej pozycji dla bloku dawcy, dlatego ważne jest przerwanie naciskania w momencie, gdy na prowadniku pojawi się druga oznaka.
Powoli obróć raz rączkę wybijaka. Zwolnij nacisk w dół, wciąż trzymając blok donora na mostku dla bloku donora. Wyjmij mostek oraz blok donora.
Należy upewnić się, że wycinak donora jest wyrównany z otworem wykonanym wcześniej. Pozycję wycinaka należy dostosować za pomocą śrub ustalających. Jeśli wycinak donora i otwór w bloku biorcy nie są wyrównane, należy ostrożnie pchnąć wycinak w dół, aż jego końcówka dotknie górnej krawędzi otworu w bloku biorcy.
Utrzymując tę pozycję, należy za pomocą zgłębika opróżnić rdzeń tkanki do otworu. Powierzchnia rdzenia powinna znajdować się na jednym poziomie z powierzchnią bloku. Przesunąć obrotnicę z powrotem do wycinaka odbiorczego.
Przesuń do następnej pozycji za pomocą pokręteł regulacji XY i powtórz proces pobierania próbki z bloku odbiorczego, aż do czasu utworzenia pełnej macierzy. Aby wyjąć blok odbiorczy, poluzuj śruby w uchwycie. Połóż blok stroną do dołu na szkiełku przedmiotowym umieszczonym na odpowiedniej statywie i poddaj blok działaniu temperatury 42 °C przez 40 minut.
Wyjmij preparat i bloczek z pieca, a następnie wyrównaj powierzchnię bloczka, delikatnie przesuwając szkiełko przedmiotowe. Umieść bloczek wraz ze szkiełkiem na płytce chłodzącej na 10 minut. Zdejmij szkiełko przedmiotowe z bloczka.
Blok jest teraz gotowy do cięcia. Po wykonaniu serii cięć, przeprowadź barwienie oraz digitalizację macierzy tkankowej (TMA) z użyciem przeciwciała przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania. Wyszukaj to białko w bazie Human Protein Atlas, odwiedzając stronę internetową www.proteinatlas.org.
Wprowadź nazwę białka, identyfikator zespołu (ensemble id), numer dostępu UniProt lub nazwę HGNC, na przykład insulinę. Kliknij wybrane białko i przewiń w dół do sekcji podsumowania tkanek i organów prawidłowych. Przegląd przedstawia ekspresję białka w trzustce.
Kliknij kartę. Więcej danych o tkankach. Pojawi się widok tkanek prawidłowych uporządkowany według organów.
Kliknij trzustkę, aby wyświetlić wyniki IHC dla trzech przeciwciał skierowanych przeciwko temu samemu białku. Kliknij obraz, aby wyświetlić obraz trzustki w wysokiej rozdzielczości. Na tej ilustracji przedstawiono przykłady jakości macierzy tkankowych: prostą i prawidłowo wyrównaną macierz z wystarczającą przestrzenią między rzędami i kolumnami a krawędzią parafiny. Tutaj niektóre rdzenie znajdują się zbyt blisko krawędzi, co prawdopodobnie spowoduje problemy podczas krojenia sekcji.
Ta matryca tkanek (TMA) była suszona zbyt długo i uległa zapadnięciu z powodu braku odpowiedniego szablonu. Tutaj prawidłowo wycięty przekrój z prostymi i wyrównanymi kolumnami został zabarwiony hematoksyliną i eozyną. Zużyte lub zanieczyszczone ostrze może spowodować rozwarstwienie, jak pokazano tutaj, lub powstanie sprasowanych przekrojów, takich jak ten.
Komórki ośrodków zarodkowych w węzłach chłonnych wykazują optymalnie mianowane przeciwciało, co skutkuje specyficznym barwieniem cytoplazmatycznym bez tła, jak widoczne tutaj. Barwienie negatywne lub słabe występuje, gdy stężenie przeciwciała pierwszorzędowego jest zbyt niskie lub gdy białko docelowe nie występuje w tkankach poddanych immunobarwieniu. Ten przekrój tkanki jest przebarwiony z powodu zbyt wysokiego stężenia przeciwciała pierwszorzędowego.
Ciemny kolor powoduje trudności w określaniu lokalizacji subkomórkowej ze względu na prześwit sygnału (spillover), reaktywność krzyżową i fałszywie dodatnie wyniki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przygotować macierz markerów tkankowych oraz jak wykorzystać ją podczas analizy ekspresji białek z wykorzystaniem immunohistochemii. Powinni Państwo również wiedzieć, jak korzystać z Human Protein Atlas w celu analizy ekspresji białek w ludzkich tkankach i komórkach.
Przegląd
Mikromacierze tkankowe stanowią wydajną metodę jednoczesnego gromadzenia informacji z wielu tkanek w celu analizy ekspresji białek. Technika ta polega na zgromadzeniu reprezentatywnych próbek tkanek w jednym bloku parafiny, który następnie jest cięty w celu przeprowadzenia immunohistochemii i obrazowania cyfrowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia
- Histologia
Wstęp
- Mikromacierze tkankowe umożliwiają wysokoprzepustową analizę ekspresji białek.
- Metoda ta pozwala na oszczędność materiału biologicznego w porównaniu z tradycyjnymi metodami opartymi na pojedynczych blokach tkankowych.
- Zwiększa ona powtarzalność oraz redukuje koszty i czas przetwarzania.
- Wygenerowane dane mogą zostać zintegrowane z zasobami takimi jak Human Protein Atlas.
Cel badania
- W celu zademonstrowania procedury tworzenia mikromacierzy tkankowych.
- W celu analizy wzorców ekspresji białek w różnych tkankach.
- W celu przedstawienia zestandaryzowanej metody wysokoprzepustowej analizy tkanek.
Zastosowane metody
- Wybór i zaznaczenie reprezentatywnych obszarów w tkankach zatopionych w parafinie.
- Wykrawanie rdzeni tkankowych i składanie ich w blok mikroarray tkankowej.
- Przeprowadzenie immunohistochemii na skrawkach z mikroarray.
- Analiza wzorców ekspresji białek i publikacja wyników.
Główne wyniki
- Skuteczny montaż matryc tkankowych (TMA) do analizy białek.
- Wykazanie powtarzalności i wydajności w badaniach ekspresji białek.
- Integracja wyników z bazą Human Protein Atlas.
- Wizualna reprezentacja wzorców ekspresji białek za pomocą obrazowania cyfrowego.
Wnioski
- Mikromacierze tkankowe są cennym narzędziem do wysokoprzepustowej analizy ekspresji białek.
- Metoda ta zwiększa wydajność i pozwala na oszczędność próbek biologicznych.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia rozmieszczenia białek w tkankach.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Technologia mikromacierzy tkankowych umożliwia wysokoprzepustową analizę ekspresji białek przy jednoczesnym oszczędzaniu rzadkiego materiału biologicznego, co wspiera szeroko zakrojone wysiłki w zakresie walidacji celów terapeutycznych w procesie odkrywania leków. Poprzez integrację danych z publicznymi zasobami, takimi jak Human Protein Atlas, dostarcza ona skalowalnych podstaw do ograniczania ryzyka mechanistycznego oraz identyfikacji biomarkerów translacyjnych w różnych obszarach chorobowych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania poprzez generowanie powtarzalnych, ilościowych profili ekspresji białek z ograniczonej liczby próbek pacjentów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w tkankach zdrowych i chorobowych w celu wyjaśnienia wzorców ekspresji celu.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza zużycie próbek biologicznych, zwiększając jednocześnie przepustowość kampanii przesiewowych przeciwciał lub celów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję portfolio poprzez dostarczanie wczesnych dowodów na specyficzność celu oraz jego rozkład tkankowy.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie standaryzowanych, ilościowych wyników immunohistochemii w celu oceny specyficzności odczynników w setkach rdzeni tkankowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia zapewnienie powtarzalnych warunków analizy przy użyciu jednego protokołu barwienia, co minimalizuje zmienność eksperymentalną w przesiewach na dużą skalę.
- Wartość platformy: Umożliwia tworzenie wielokrotnego użytku bloków mikroarray do podłużnego profilowania paneli białkowych w kohortach chorobowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Jest zgodna z systemami istotnymi dla przebiegu choroby poprzez profilowanie ekspresji białek w tkankach nowotworowych pochodzących z dobrze opisanych kohort pacjentów.
- Wartość operacyjna: Ułatwia walidację biomarkerów dzięki spójnemu cięciu i obrazowaniu cyfrowemu preparatów TMA.
- Wartość translacyjna: Wspiera postęp w badaniach z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez powiązanie ekspresji celu z danymi patologii klinicznej w publicznych bazach danych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Produkcja matryc tkankowych (Tissue microarray) wpisuje się w kontinuum odkryć, od identyfikacji celu po walidację przedkliniczną, umożliwiając wydajne profilowanie ekspresji białek na szeroką skalę.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez umożliwienie jednoczesnej analizy ekspresji białek w wielu typach tkanek i stanach chorobowych.
- Screening: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne skrawki tkanek, odpowiednie do wysokoprzepustowych kampanii screeningu immunohistochemicznego.
- Analityka: Generuje mierzalne dane dotyczące ekspresji białek za pomocą cyfrowej analizy obrazu, co umożliwia porównawczą ocenę warunków.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z ciągłością przedkliniczną za pomocą map ekspresji białek powiązanych z adnotowanymi próbkami pacjentów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy zstandaryzowaną, skalowalną platformę do wielokrotnego użytku w wielu projektach walidacji przeciwciał i charakterystyki celów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki multipleksowej analizie tkanek.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację między laboratoriami poprzez minimalizację zmienności między preparatami.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez maksymalizację uzysku danych z ograniczonych próbek klinicznych lub przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów w oparciu o ryzyko na podstawie kompleksowego profilowania ekspresji w tkankach zdrowych i chorobowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu histologii, obchodzenia się z tkankami oraz technik składania macierzy tkankowych (tissue microarray).
- Jest uzależnione od precyzyjnej aparatury do wycinania rdzeni, ich wyrównywania i sekcjonowania.
- Wymaga ustandaryzowanych protokołów barwienia, obrazowania i adnotacji danych w celu zapewnienia porównywalności między badaniami.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metod przy zastosowaniu w różnych systemach modelowych lub tkankach niepochodzących od ludzi.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne związane z wyrównaniem rdzeni, integralnością przekrojów i optymalizacją barwienia, zgodnie z opisami w demonstracjach proceduralnych.
