Przygotowanie próbek ekstraktów z Mycobacterium tuberculosis do metabolomicznych badań metodą rezonansu magnetycznego jądra

Celem niniejszej procedury jest analiza ekstraktów bezkomórkowych z Mycobacterium tuberculosis za pomocą metabolomiki NMR poprzez pierwszą hodowlę i zbiorowanie komórek na odpowiednim etapie wzrostu. Następnie należy zlizować komórki i uzyskać ekstrakty bezkomórkowe do analizy. Zliofilizowane ekstrakty należy resuspendować w buforze do analizy NMR.

Na koniec należy zebrać dane NMR i przeanalizować widma za pomocą oprogramowania w celu zidentyfikowania metabolitów. W ostateczności analiza NMR mycobacterium tuberculosis jest wykorzystywana do wykazania zachowania poziomów metabolitów po różnych zabiegach. Metabolomika NMR może być zastosowana do kluczowych aspektów fizjologii mycobacterium tuberculosis, takich jak istotne szlaki metaboliczne.

Zrozumienie to jest kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów działania leków oraz mechanizmów oporności, a także dla zidentyfikowania nowych celów w projektowaniu leków. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na brak możliwości identycznego potraktowania wszystkich próbek, co wprowadza niepotrzebną zmienność do wyników z mojego laboratorium. Steven Luka, doktorant, zaprezentuje procedury przygotowania próbek do analizy NMR. Następnie kierownik laboratorium badawczego oraz Robert Fenton, technik badawczy III stopnia, zaprezentują procedury postępowania z kulturami mycobacterium tuberculosis podczas prowadzenia badań nad M tuberculosis.

Badania prowadzono zgodnie z zasadami trzeciego poziomu biosafety (BSL-3), zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Choć ze względów bezpieczeństwa biologicznego etykiety w tym filmie wskazują na Mycobacterium tuberculosis, w demonstracji tej wykorzystano niepatogenne Mycobacterium magmatic. Pracę rozpoczynamy od rozmrożenia na lodzie zapasu M. tuberculosis w 50% glicerolu.

Wprowadzić 0.15 ml do 110 ml bulionu M-A-D-C-T-W w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml i hodować kultury w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 100 RPM przez około sześć dni. Jeśli nie są wymagane antybiotyki, dodatki alternatywne lub inne zabiegi, zebrać kultury. W przypadku kultur wymagających zabiegów, zebrać je po ich przeprowadzeniu.

Odstaw 0.5 milliliter Eloqua na lodzie do hodowli, miareczkowania i kontroli jakości. Następnie przeprowadź wybrany zabieg i umieść hodowle z powrotem w inkubatorze wytrząsowym po upływie czasu trwania zabiegu. Pobierz one milliliter i wyznacz OD 600.

Należy również odstawić próbkę o objętości 0,5 ml do hodowli, miareczkowania i kontroli jakości. Przez cały pozostały czas trwania protokołu komórki należy przechowywać w lodzie. Komórki należy zebrać do czterech probówek o pojemności 50 ml poprzez wirowanie, po uprzednim przemyciu 15 ml lodowatej wody dwukrotnie destylowanej.

Resuspenduj pellet w 10 mililitrowych aliquotach. Pobierz dwie aliquoty i odwiruj je w wirówce, a następnie resuspenduj pellet komórkowy w końcowej objętości 1 mililitra wody dwukrotnie destylowanej. Jeśli wymagana jest pojedyncza zawiesina komórkowa bez grudek, przepuść komórki przez igłę 27G.

Trzykrotnie przenieś 1 ml zawiesiny komórkowej do probówki o pojemności 2 ml z zakrętką, zawierającej macierz lizującą B. Umieść homogenizator do lizy FastPrep 24 w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Umieść próbki w uchwycie na próbki, zabezpieczając je płytką blokującą. Następnie inkubuj przez 60 s przy ustawieniu prędkości 6 m/s.

Następnie odwirować próbki w celu osadzenia szczątków komórkowych oraz całych komórek. Potem przepuścić nadsącz przez filtr strzykawkowy o porach 0,2 mikrona do sterylnej probówki, aby potwierdzić brak żywych komórek. Wysiać 0,1 mililitra próbki na podłoże MADC.Agar.

Zamrozić próbki w kąpieli z etanolu i suchego lodu, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu liofilizacji i analizy w pracowni NMR. Po dwóch miesiącach sprawdzić płytki w celu weryfikacji braku jednostek tworzących kolonie. Jeśli nie stwierdzono obecności CFU, próbki mogą zostać wyniesione z laboratorium BSL-3 do dalszych analiz w standardowej pracowni NMR.

Po wysuszeniu próbek do całkowitego odparowania, zawiesić je ponownie w 0,7 milliliters buforu do NMR i przenieść do probówki do mikrocentryfugi, a następnie wirować przez trzy minuty przy 13 000 ×g. Pobrać 0,6 milliliters i przenieść do pięciomilimetrowej probówki NMR. W przypadku analizy wielu próbek, specjalny stojak ułatwia wprowadzanie wielu probówek NMR do wirówek na odpowiednią głębokość.

Następnie przenieś próbki do spektrometru NMR, aby umieścić je w automatycznym podajniku próbek A-B-A-C-S na 20 miejsc. Próbki z kultur nieleczonych i leczonych lekiem należy rozmieszczać naprzemiennie. Pierwsza próbka musi zostać wprowadzona do magnesu przed rozpoczęciem automatycznego pomiaru.

Aby skalibrować przyrząd, zoptymalizuj długość impulsu 90 stopni dla pojedynczej próbki, a następnie dostrój instrument dla pozostałych próbek. Użyj funkcji NMR i grad shim. Zautomatyzuj blokowanie, shimowanie oraz gromadzenie danych NMR dla każdej próbki.

W przypadku jednowymiarowego widma NMR protonowego (¹H) należy wybrać sekwencję impulsów z supresją sygnału wody i techniką excitation sculpting. Dla dwuwymiarowego widma ¹H-¹³C HSQC należy ustawić łącznie 32 000 punktów danych, 128 skanów oraz 16 skanów dummy. Wybierz odpowiednią sekwencję impulsów.

Wybierz łącznie 2048 punktów danych z szerokością sweep wzdłuż bezpośredniego wymiaru H1 oraz 64 punkty danych z szerokością sweep wzdłuż pośredniego wymiaru C13. Określ również akwizycję widma z 128 skanami i 16 skanami dummy, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu. Widmo m. tuberculosis wygenerowało około 400 pików, w tym 50 znanych metabolitów.

Na przykład przetwarzanie danych, opisane szczegółowo w towarzyszącym manuskrypcie, pozwoliło uzyskać widmo metabolitów bezpośrednio lub pośrednio powiązanych ze szlakiem D-alaniny. Wielkość intensywności pików jest proporcjonalna do stężeń metabolitów obecnych w ekstrakcie komórkowym, dzięki czemu można ilościowo określić względne zaburzenia w metabolitach i szlakach metabolicznych pomiędzy próbkami i wariantami traktowania. Metabolomika LMR otwiera drogę badaczom w dziedzinie bakteriologii do zgłębiania fizjologii i patogenezy w sposób wizualny u mikrobakterii oraz innych patogennych lub niepatogennych mikroorganizmów.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiąść dokładną wiedzę na temat przygotowania wielu ekstraktów komórkowych prątków gruźlicy do metabolomiki NMR oraz, co szczególnie ważne, na temat zachowania spójności w całym protokole w celu uzyskania wiarygodnych wyników.