Techniki analityczne do badania bioaktywności tlenku azotu

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zaprezentowanie sposobu dokładnego i specyficznego wykrywania metabolitów tlenku azotu w próbkach biologicznych. Osiąga się to poprzez przetwarzanie próbek krwi bezpośrednio po pobraniu, aby zapobiec utracie metabolitów lub powstawaniu artefaktów. Równolegle przeprowadza się szybki i wydajny pobór tkanek, aby zminimalizować wpływ środowiska hipoksyjnego na metabolity tlenku azotu.

Pierścienie aorty są pobierane i zawieszane w kąpieli organowej w celu oceny funkcji śródbłonka. Ponadto stosuje się analizy biochemiczne do ilościowego oznaczenia poziomu azotanów, azotynów oraz względnych poziomów nitrotioli i innych produktów nitrowania w tkance. Wykorzystanie tych analiz do prawidłowego porównania zwierząt doświadczalnych i kontrolnych pozwala na uzyskanie cennych informacji na temat produkcji i metabolizmu tlenku azotu.

Główną zaletą zastosowania tego podejścia wielosystemowego w porównaniu z pojedynczymi metodami lub analizami jest możliwość uzyskania szerszego obrazu biochemia tlenku azotu w wielu układach narządowych. Dzięki temu możemy zacząć rozumieć, które z tych metabolitów mogą mieć znaczenie prognostyczne lub diagnostyczne oraz w jaki sposób zestaw metabolitów tlenku azotu odzwierciedla tworzenie i dostępność tlenku azotu w śródbłonku. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ każdy etap procesu ma krytyczne znaczenie dla zachowania integralności próbki.

Niektóre z tych etapów nie są oczywiste po przeczytaniu sekcji metod w typowych czasopismach ze względu na szczegółowość procesu pobierania próbek i ekstrakcji tkanek. Procedurę tę zademonstruje dr Hong Jing, starszy naukowiec w moim laboratorium. Na potrzeby tego protokołu należy zapewnić osobę lub zwierzę doświadczalne do pobrania krwi, przy czym w przypadku zwierząt doświadczalnych badane będą również ich tkanki.

Najpierw pobierz krew pełną, wprowadzając igłę o rozmiarze 25 G do żyły głównej dolnej. Po zebraniu od 500 do 1000 µL wypłucz organizm zwierzęcia z pozostałej krwi, wprowadzając bufor fizjologiczny przez wierzchołek lewej komory, i poczekaj do całkowitej wymiany krwi, podczas gdy krew i bufor wypływają przez żyłę główną dolną. Krew żylną należy zebrać do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml zawierających NEM i EDTA bezpośrednio po pobraniu.

Po odwirowaniu krew należy wirować przy 14 300 RCF przez siedem minut. Osocze należy odessać pipetą z osadu erytrocytów i przenieść do oddzielnej probówki. Próbki wyizolowanego osocza należy przygotować do analizy HPLC, dodając najpierw objętość zimnego metanolu w stosunku jeden do jednego do 50 µL pobranego osocza.

Mieszaninę energicznie mieszaj w wortexie przez trzy do pięciu sekund, aż stanie się mętna. Następnie odwiruj mieszaninę z prędkością 14 300 RCF przez siedem minut. Aby wytrącić białka osocza, przelej nadsącz do osobnej probówki o pojemności 1,5 ml i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu analizy.

Aby przygotować osocze do analizy chemiluminescencyjnej, należy pobrać pozostałą objętość osocza, która powinna wynosić około 200 do 400 µL, i podzielić ją na dwie części. Jedną połowę osocza przygotowuje się poprzez dodanie 10% objętości 5% zakwaszonego siarczku i odczekanie 10 minut. Ta próbka jest teraz gotowa do analizy CLD.

Przygotuj pozostałą połowę osocza, dodając po pięciu minutach 10% objętości 2% chlorku rtęci. W temperaturze pokojowej dodaj 10% objętości zakwaszonego sulfonamidu. Odczekaj kolejne 10 minut i wstrzyknij tę próbkę do CLD w taki sam sposób jak w przypadku osocza.

Osad RBC można przygotować do analizy HPLC lub CLD. Należy rozpocząć od zmieszania jednej części osadu komórkowego z czterema częściami hipotonicznego roztworu lizującego. W przypadku analizy CLD mieszaninę należy dokładnie wymieszać za pomocą vortexa.

Przygotowanie komórek przebiega w ten sam sposób, co w przypadku osocza. Należy rozpocząć od dodania równiej objętości metanolu. Następnie mieszaninę należy energicznie wymieszać w wibratorze (vortex) przez trzy do pięciu sekund, a następnie wirować przez siedem minut przy 14 300 RCF.

Następnie odpipetuj naddestrat i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu analizy metodą HPLC w celu oznaczenia poziomów metabolitów tlenku azotu w tkankach. W przypadku wybranych tkanek pobranych od zwierząt doświadczalnych, w pierwszej kolejności należy pobrać i przygotować krew zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji; pobieranie tkanek powinno odbywać się w sposób standardowy, ze szczególnym uwzględnieniem szybkości i wydajności, aby zapobiec wystąpieniu hipoksji w tkankach. Po pobraniu próbki, homogenizuj tkanki w stosunku jeden do pięciu w PBS zawierającym N-E-M-E-D-T-A.

Następnie przygotuj zhomogenizowane tkanki do analizy HPLC i CLD zgodnie z opisem w poprzednich sekcjach dla erytrocytów. Po znieczuleniu dorosłej myszy eterem dathylowym i potwierdzeniu braku reakcji na uciśnięcie palca u nogi, wykonaj torakotomie. Nacięcie w linii pośrodkowej wykonuje się od mostka w dół do okolicy łonowej, aby odsłonić jamę klatki piersiowej i jamią brzuszną.

Następnie przeprowadź perfuzję zwierzęcia natlenionym buforem Krebsa-Henselepa. Użyj strzykawki o rozmiarze 25 G, aby wstrzyknąć bufor do wierzchołka lewej komory. Prawy przedsionek musi zostać przecięty, aby umożliwić odpływ krwi.

Po perfuzji wyizoluj aortę brzuszną, odcinając i usuwając wątrobę, płuca oraz inne tkanki, które mogą zasłaniać aortę. Następnie, trzymając serce pęsetą, ostrożnie odetnij aortę od tylnej ściany ciała zwierzęcia. Umieść serce i aortę w szalce Petriego wypełnionej lodem.

Zimny bufor Krebsa w spodku. Ostrożnie wyciąć i usunąć tłuszcz oraz osierdzie z aorty. Podczas oczyszczania należy unikać uszkodzenia śródbłonka wewnątrz naczynia.

Aby zapobiec hipoksji, należy utrzymać spowolniony metabolizm aorty, przenosząc ją co pięć minut do świeżego, lodowatego, natlenionego buforu. Następnie za pomocą skalpela należy pociąć aortę na pierścieniowate segmenty o długości 3 mm. Segmenty należy przenieść do czterokanałowej kąpieli tkankowej o pojemności 10 ml, wypełnionej natlenionym buforem Krebsa.

Używając pokrętła przetwornika, zastosuj 1,5 g wstępnego napięcia do każdego pierścienia aorty. Zgodnie z ustaleniami empirycznymi, 1,5 g jest odpowiednim napięciem początkowym dla optymalnej funkcji naczynioruchowej.

U myszy monitoruj i rejestruj pomiar siły za pomocą ośmiokanałowego mostka oktalnego oraz oprogramowania do akwizycji danych; pozwól pierścieniom na equilibrację przez 80 minut, wymieniając bufor co 20 minut, a następnie przystąp do eksperymentu. Po wyrównaniu się napięcia tkanki dodaj 100 nM fenylryny do każdego pierścienia w celu wywołania podmaksymalnego skurczu. Gdy napięcie pierścienia się ustabilizuje i osiągnie stały poziom tonusu, przeprowadź analizę zależności dawka-odpowiedź na agonistę śródbłonka, taki jak acetylocholina.

Pozwoli to określić produkcję tlenku azotu oraz stopień rozkurczu naczyń. Po zbadaniu odpowiedzi dawka-reakcja na acetylocholinę, należy wypłukać kąpiele buforem Krebsa i dodać 100 nM rine z kopru do każdej kąpieli z organem w celu skurczenia naczyń. Następnie ponownie należy określić reaktywność pierścieni mięśni gładkich na egzogenne źródło tlenku azotu, takie jak nitroprusyd sodu, w obecności i bez ODQ, inhibitora rozpuszczalnej cyklazy guanylowej.

Taki sposób podejścia pozwoli wyznaczyć wartość 100% rozkurczu naczyń, a także wykaże kluczową rolę rozpuszczalnej cyklazy guanylowej w pośredniczeniu odpowiedzi tlenku azotu prowadzącej do rozkurczu naczyniowego. Ponieważ ODQ zapobiega rozkurczowi indukowanemu przez nitroprusjan sodu w odpowiedzi na acetylocholinę, pierścienie aorty myszy zdrowej kontrolnej uległy rozkurczowi, podczas gdy pierścienie aorty myszy z dysfunkcją śródbłonka wykazały zmniejszony rozkurcz wynikający z obniżonej produkcji tlenku azotu. U zwierząt z grupy kontrolnej przeprowadzono również specyficzne dla grupy analizy denitrozacji w oparciu o chemiluminescencję azotynów.

RSNO oraz RNNO wykryto za pomocą redukcyjnego testu denitrozowania. Po odjęciu powierzchni piku zmierzono poziomy azotynów oraz r sno. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii tlenku azotu i naczyń krwionośnych, takie jak: w jaki sposób krążące poziomy tych metabolitów tlenku azotu odzwierciedlają poziomy tkankowe oraz jak zmieniają się metabolity w zależności od różnych stanów chorobowych?

Wyznaczenie stężeń stanu stacjonarnego oraz okresu półtrwania tych istotnych metabolitów tlenku azotu w wielu układach organów oraz w całym krwiobiegu jednego zwierzęcia pozwoli na identyfikację specyficznych sygnatur molekularnych procesów chorobowych i pomoże nam zdefiniować nowe metody leczenia oparte na tlenku azotu, co wyposaży klinicystów w lepsze biomarkery ciężkości lub progresji choroby. Zazwyczaj osoby nowo zajmujące się dziedziną tlenku azotu napotykają trudności, ponieważ wiele metod nie jest wystarczająco czułych, aby wykryć i skwantyfikować te niskie poziomy metabolitów tlenku azotu występujących w próbkach biologicznych. Przede wszystkim, osoba nieposiadająca wprawy w tej technice prawdopodobnie stworzy artefakty podczas przetwarzania próbek, co prowadzi do błędnych danych i błędnej interpretacji wyników.